龔瑞昆 劉 雙 崔傳金（華北理工大學(xué)唐山市先進(jìn)測試與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北 唐山 063009）

生物傳感器檢測牛奶體細(xì)胞的研究進(jìn)展

龔瑞昆 劉 雙*崔傳金（華北理工大學(xué)唐山市先進(jìn)測試與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北 唐山 063009）

牛奶中體細(xì)胞數(shù)是評(píng)價(jià)新鮮牛奶質(zhì)量和奶牛乳腺健康狀況的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，生物傳感器在牛奶體細(xì)胞檢測中有較好的優(yōu)勢。本文簡介了生物傳感器的構(gòu)成和原理，對(duì)近幾年生物傳感器在檢測牛奶體細(xì)胞方面的研究和應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并對(duì)未來的發(fā)展進(jìn)行了預(yù)測。

牛奶中的體細(xì)胞數(shù)(Somatic Cell Count, SCC)是評(píng)價(jià)新鮮牛奶質(zhì)量和奶牛乳腺健康狀況的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[1]，是指每ml牛奶中的細(xì)胞總數(shù)，主要含有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等大量的白細(xì)胞及少量的乳腺上皮細(xì)胞。奶牛的乳腺受到感染后，體內(nèi)白細(xì)胞就會(huì)增多，連同受損脫落的上皮細(xì)胞一起進(jìn)入乳汁，以致乳汁中的體細(xì)胞數(shù)升高，大量的體細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致牛奶中脂肪、酪蛋白、乳糖以及鈣、鉀等離子等營養(yǎng)物質(zhì)含量降低[2，3]，最終影響奶產(chǎn)品的質(zhì)量。國際上以20萬/ml的SCC為區(qū)分奶牛是否感染乳腺炎的臨界值，以50萬/ml以上的SCC定為乳腺炎的基準(zhǔn)[4]。為進(jìn)一步量化判斷奶?；疾〉那闆r，目前通常采用加利福尼亞檢測法CMT的標(biāo)準(zhǔn)[5]，如附表所示。

附表 CMT判斷標(biāo)準(zhǔn)

迄今為止，檢測牛奶中體細(xì)胞的方法分為直接法和間接法[6，7]。直接法包括顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù)法、Fossomatic計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法、庫爾特計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法、計(jì)算機(jī)視覺鏡檢法；間接法包括CMT檢測法、DNA含量測定法、介電常數(shù)法、pH法、凝乳法、酯酶法、近紅外線檢測法、超聲波測定法、生物發(fā)光ATP法、生物傳感器檢測法等。其中，生物傳感器有特異性好、靈敏度高、檢測時(shí)間短、易操作等優(yōu)勢，本文就生物傳感器在檢測牛奶中體細(xì)胞的研究和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，并討論了未來發(fā)展的趨勢。

1 生物傳感器的構(gòu)成和原理

生物傳感器是生物信息學(xué)、仿生學(xué)、物理學(xué)、信息科學(xué)、分析化學(xué)等多學(xué)科交叉的產(chǎn)物。它主要由生物敏感膜和換能器連接組成，生物敏感膜可以是酶、組織、全細(xì)胞、高分子聚合物模擬酶等，可直接固定在換能器表面，也可固定在換能器表面的基膜上(納米薄膜等)；換能器可以是電極、熱敏電阻、光纖、壓電晶體、微懸臂梁等。生物傳感器基本原理[8]為：待測物通過擴(kuò)散進(jìn)入到生物敏感膜層，經(jīng)分子識(shí)別后發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生電、光、聲、熱、質(zhì)量等信號(hào)，然后被相對(duì)應(yīng)的換能器轉(zhuǎn)變成可定量處理的電信號(hào)，再通過分析處理得到被測物的濃度。

2 生物傳感器在牛奶體細(xì)胞檢測中的研究與應(yīng)用

基于微流控技術(shù)、電測量方法、細(xì)胞熒光染色技術(shù)、電化學(xué)傳感技術(shù)等方法的生物傳感器，近幾年的研究進(jìn)展如下。

2.1 微流控技術(shù)檢測法 （1）微流控是指使用微米級(jí)的微管道處理或操控微小流體，微流體技術(shù)包括連續(xù)流動(dòng)微流控芯片技術(shù)和數(shù)字微流體技術(shù)，也被稱為芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a Chip)，在生物檢測領(lǐng)域廣泛研究和應(yīng)用[9]。（2）Garcia等人[10]研發(fā)出一種用于牛奶中細(xì)胞檢測的微流控電子檢測裝置。將新鮮奶樣放入裝置中，離心后會(huì)產(chǎn)生一定高度的細(xì)胞團(tuán)，依據(jù)細(xì)胞團(tuán)的高度來評(píng)估鮮奶中細(xì)胞數(shù)量。雖然該裝置檢測速度快、檢測成本低，且檢測結(jié)果與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果一致，但檢測精度不高。Chol等[11]研究制作了能同時(shí)檢測出新鮮牛奶中微生物、抗生素殘留物和體細(xì)胞含量的微通道芯片傳感器。檢測機(jī)理是使用熒光顯微鏡檢測目標(biāo)分析物(抗原)與對(duì)應(yīng)抗體的免疫性結(jié)合物，并根據(jù)結(jié)合物的量的大小判斷細(xì)胞等分析物的數(shù)量。該傳感器成功檢測出了大腸桿菌、無乳鏈球菌、青霉素、雙氫鏈霉素和中性粒細(xì)胞。Shohei Kimura[12]制作了檢測牛奶中的中性粒細(xì)胞含量的電化學(xué)微流控芯片式傳感器。傳感器采用三電極結(jié)構(gòu)，工作電極是一個(gè)面積為2mm2、由143根微柱金電極組成、微柱直徑和間距為20μm的矩形電極，并先后修飾了半胱氨酸薄膜、P選擇素和超氧化物歧化酶；飽和Ag/AgCl電極、金電極分別為參比電極、輔助電極。基本原理是：中性粒細(xì)胞滲出的超氧陰離子參與氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生的電子直接傳導(dǎo)到電極中。響應(yīng)電流和中性粒細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系，檢測下限為4.8×105個(gè)/ml。張學(xué)超等[13]報(bào)道了基于分析細(xì)胞的電容值、濃度和大小百分比之間關(guān)系來定量檢測牛奶體細(xì)胞的方法。采用鉑為電極材料，聚四氟乙烯為電極體微通道管體材料，銅質(zhì)屏蔽線為電極引線，設(shè)計(jì)制作了微通道電化學(xué)傳感器。最后以細(xì)胞電容、樣品溫度和細(xì)胞大小百分比為神經(jīng)元，建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，預(yù)測了N、T、1、2級(jí)奶樣體細(xì)胞的含量，正確率分別為：73.56%、65.78%、89.03%、94.32%。結(jié)果表明對(duì)1、2級(jí)的檢測精度較高，對(duì)N、T級(jí)的檢測精度較低。（3）芯片實(shí)驗(yàn)室開辟了對(duì)新鮮牛奶體細(xì)胞檢測和奶牛乳腺炎診斷的新思路和新方法。該法具有檢測精度高、重復(fù)性能好、樣品消耗低等特點(diǎn)[14]，但是現(xiàn)在還處于實(shí)驗(yàn)室檢測階段，面向大型奶場、個(gè)體奶戶的現(xiàn)場檢測還不完善。

2.2 電測量方法 （1）感染了乳腺炎所產(chǎn)的牛奶的導(dǎo)電性能增強(qiáng)，可以通過檢測介電常數(shù)、電導(dǎo)率等電參數(shù)來確定牛奶中體細(xì)胞的數(shù)量。（2）Grillo等人[15]制作了基于測量牛奶介電常數(shù)的生物傳感器。檢測機(jī)理是：測試時(shí)，若施加較低頻率的電信號(hào)，細(xì)胞內(nèi)的離子在此信號(hào)頻率的電場下不易被極化，所以體細(xì)胞介電常數(shù)的數(shù)值較低；當(dāng)施加和體細(xì)胞形態(tài)相關(guān)的頻率時(shí)，細(xì)胞會(huì)明顯表現(xiàn)出極化現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)離子震動(dòng)，導(dǎo)致介電常數(shù)顯著升高。因?yàn)椴煌l率下測得的介電常數(shù)值會(huì)有很大的不同，因此可以此來估計(jì)原奶中的細(xì)胞含量。Weichen Li等

[16]研究制作了測定新鮮牛奶質(zhì)量的雙線圈電感芯片傳感器。傳感器結(jié)構(gòu)尺寸的設(shè)計(jì)基于COMSOL軟件模擬仿真線圈的勵(lì)磁感應(yīng)參數(shù)得到。傳感器主要包含硅基底和兩個(gè)共面線圈，線圈均與輸入輸出電極相連。檢測原理是：線圈完全浸入奶樣中，對(duì)勵(lì)磁線圈施加特定的交流信號(hào)，感應(yīng)線圈產(chǎn)生的感應(yīng)信號(hào)發(fā)生相移。相移隨牛奶中細(xì)胞濃度的增大而增大。在細(xì)胞濃度為2～500千個(gè)/ml范圍內(nèi)，被測相移與細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系，變化范圍是65°～86°，決定系數(shù)R2為0.8696。并且相移隨勵(lì)磁頻率增加而增大，當(dāng)勵(lì)磁頻率為9MHz時(shí)，檢測靈敏度為3°/log(SCC)。結(jié)果表明該傳感器能夠有效區(qū)分新鮮牛奶的質(zhì)量。Kamphuis等[17]進(jìn)行了在線復(fù)合體細(xì)胞(ISCC)傳感器聯(lián)合電導(dǎo)率(EC)檢測技術(shù)在線自動(dòng)檢測牛奶中體細(xì)胞的電化學(xué)生物傳感器。傳感器針對(duì)自動(dòng)擠奶設(shè)備，自動(dòng)在線檢測新西蘭06～07年、200頭奶牛所產(chǎn)牛奶中的體細(xì)胞數(shù)量，并診斷奶牛是否患有臨床乳腺炎。同時(shí)采用Fossomatic計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法進(jìn)行對(duì)比檢測試驗(yàn)。傳感器采用模糊邏輯算法分析數(shù)據(jù)，得到靈敏度為80%，成功率為21.9%～32.0%，錯(cuò)誤率是1.2%～2.1%，是單獨(dú)使用ISCC和EC檢測方法的2～3倍。

2.3 熒光技術(shù)檢測法 （1）利用熒光技術(shù)檢測新鮮牛奶中細(xì)胞的機(jī)理通常是：首先使用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞膜打破，釋放DNA，然后利用熒光電子發(fā)生器或者熒光染料對(duì)DNA進(jìn)行著色，利用虹吸效應(yīng)使其平均分布在檢測芯片上，最后通過對(duì)熒光進(jìn)行測試從而達(dá)到檢測牛奶中細(xì)胞數(shù)量的目的。（2）Rodriguez等[18]制作了一次性芯片傳感器，可將牛奶放在芯片上不同的反應(yīng)室里與染液混合，利用虹吸作用使染色后的細(xì)胞均勻地分布在牛奶檢測芯片內(nèi)，用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)牛奶中的細(xì)胞數(shù)量。Moon等[19]研制出了一種用于牛奶質(zhì)量分析的便攜式檢測裝置。裝置包含一次性塑料芯片、染液、熒光顯微鏡、圖像分析儀等部件，共重17kg，它的基本原理是將細(xì)胞染色并使用熒光顯微裝置掃描，最后通過圖像分析軟件自動(dòng)測量細(xì)胞的數(shù)量。與Fossomatic計(jì)數(shù)法相比，平均差異小與0.004，具有有效的重復(fù)性和檢測精度，可以發(fā)展應(yīng)用于大型牛場的牛奶質(zhì)量檢測。Janice等[20]設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種實(shí)時(shí)自動(dòng)檢測牛奶體細(xì)胞的脫氧核糖核酸(DNA)傳感器。傳感器主要由高、低通濾波器、光電二極管、發(fā)光二極管(LED)和塑料池構(gòu)成。將樣品放入塑料池，先用LED激發(fā)染料，再由光電二極管將染料發(fā)射光轉(zhuǎn)化成電流，最后由光電放大器、低通濾波器和放大器組成的回路，將電流轉(zhuǎn)化成電壓并輸出?？梢詸z測樣品的細(xì)胞濃度范圍為5–7990萬個(gè)/ml，比試劑盒的檢測范圍寬；以線性回歸和邏輯回歸分析方程為基礎(chǔ)，檢測結(jié)果的正確率為80%。此方法能夠用于體細(xì)胞數(shù)含量的等級(jí)劃分，實(shí)現(xiàn)牛奶體細(xì)胞的實(shí)時(shí)自動(dòng)檢測，但是還需要做出一些調(diào)整來提高DNA的提取純度。

2.4 電化學(xué)傳感技術(shù)檢測法 （1）電化學(xué)生物傳感器是以能夠轉(zhuǎn)換電化學(xué)信號(hào)的電極作為換能器的生物傳感器。它的換能器不受牛奶濁度的影響，檢測過程輸出的電信號(hào)可直接在電路中轉(zhuǎn)換，且檢測樣品消耗低，電極尺寸在微米級(jí)，可以提高傳感器的靈敏度。（2）吳海云等[21]制作了一種電極厚度為0.1mm、電極指寬為0.5mm、間距為2.5mm的鉑叉指電極電化學(xué)阻抗傳感器，能夠直接檢測電極間不同體細(xì)胞含量的奶樣的阻抗。通過建立被測阻抗的等效電路模型，分析電容、電阻等參數(shù)與牛奶細(xì)胞含量的關(guān)系。結(jié)果表明，電阻部分Rs與奶牛的患病等級(jí)線性相關(guān)，該模型僅限于對(duì)于1級(jí)、2級(jí)和3級(jí)乳腺炎的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證較準(zhǔn)確，檢測精度有待提高。這為牛奶體細(xì)胞數(shù)在線檢測提供了新的思路。Yiming Huang等[22]報(bào)道了基于電化學(xué)電流式傳感器快速定量檢測新鮮牛奶中的菌落數(shù)、李斯特菌和體細(xì)胞數(shù)的研究。傳感器由一對(duì)鉑電極條組成。其中對(duì)體細(xì)胞的檢測原理是：細(xì)胞中的乳酸脫氫酶(LDH)被離心釋放到牛奶血清中；在催化作用下LDH之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)，發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電流信號(hào)。檢測時(shí)間是60s，檢測范圍在35～78萬個(gè)/ml，穩(wěn)態(tài)電流響應(yīng)和細(xì)胞濃度的線性回歸方程表示為y= 0.0059x–0.1465，決定系數(shù)R2=0.907。相較于平板計(jì)數(shù)法，此電化學(xué)傳感器更易操作，減少了人為誤差的影響，在有效、快速檢測新鮮牛奶體細(xì)胞中有應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)語

本文綜述了近幾年基于微流控技術(shù)、電測量方法、熒光染色技術(shù)、電化學(xué)傳感技術(shù)等方法的生物傳感器在牛奶體細(xì)胞檢測方面的研究應(yīng)用?？梢钥闯?，電導(dǎo)率測量方法和熒光染色測量方法比較成熟，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)面向奶場的在線檢測；微流控技術(shù)開辟了對(duì)新鮮牛奶體細(xì)胞檢測和奶牛乳腺炎診斷的新思路和新方法，具有檢測精度高、重復(fù)性能好、樣品消耗低等特點(diǎn)，但是現(xiàn)在還處于實(shí)驗(yàn)室檢測階段，面向大型奶場、個(gè)體奶戶的現(xiàn)場檢測還不完善；電化學(xué)生物傳感器在牛奶體細(xì)胞檢測的研究比較少，但是在牛奶中微生物檢測方面的研究很多[23]，微生物和體細(xì)胞之間有一定的關(guān)聯(lián)，因此可以借鑒這方面的經(jīng)驗(yàn)，并且電化學(xué)生物傳感器不受牛奶濁度的影響，檢測過程輸出的電信號(hào)可直接在電路中轉(zhuǎn)換，且檢測樣品消耗低，電極尺寸在微米級(jí)或納米級(jí)，傳感器有檢測靈敏度高、操作便攜、檢測時(shí)間短、生成成本低等特點(diǎn)，雖然電化學(xué)生物傳感器也還處于實(shí)驗(yàn)室檢測階段，但是前景一片光明。在納米科技不斷發(fā)展的今天，生物傳感器將越來越微型化，傳感器的性能將得到提升，生物傳感器在牛奶體細(xì)胞檢測和奶牛乳腺炎診斷方面有廣闊且重要的應(yīng)用研究價(jià)值。

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S818.9

A

1007-1733(2017)01-0064-03

2016–09–13）

河北省自然科學(xué)基金(青年)項(xiàng)目(F2015209308)。

*通訊作者