徐 明,謝軼群,朱佳慧,黃 斌

1.黃浦區(qū)中心醫(yī)院病理科,上海 200002;2.黃浦區(qū)中心醫(yī)院乳腺外科,上海 200002

2011年St.Gallen國際乳腺癌會議[1]專家組建議采取新的分類方法對乳腺癌患者進(jìn)行分類治療,用ER、PR、HER2與Ki-67這些臨床病理指標(biāo)來定義亞型,取代基因表達(dá)陣列標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行分類。共分為:腔面A(Luminal A-like)型、 腔面B(Luminal B-like)型、HER2型 和三陰性(triple-negative,TNBC)型,并推薦相應(yīng)的臨床實(shí)踐。近年來,乳腺癌分子亞型成為研究的熱點(diǎn),2015年St.Gallen會議[2]專家組認(rèn)為,對于HER2陰性、激素受體陽性的Luminal型如何再進(jìn)行區(qū)分,存在著較大爭議。認(rèn)為采用多基因表達(dá)檢測技術(shù)可以用來指導(dǎo)Luminal型乳腺癌患者是否需要行化療,但其價格也非常昂貴,所以在大部分地區(qū)并不能實(shí)施。國內(nèi)外對miRNAs的研究表明其在乳腺癌腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,miR-21和miR-155在乳腺癌各分子亞型中表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義[3-4],鑒別診斷Luminal型乳腺癌的相關(guān)研究鮮見報道。本研究通過qRT-PCR方法檢測miR-155和miR-21在浸潤性乳腺癌中表達(dá)量的差異,探討其在分子亞型中的鑒別診斷價值,特別是在鑒別診斷Luminal型乳腺癌中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集黃浦區(qū)中心醫(yī)院2015年3月—2015年5月期間外科手術(shù)病理證實(shí)為浸潤性乳腺癌91例。年齡33～83歲,平均(57.3±11.3) 歲?；颊叩哪[塊大小，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目，組織類型，分級，免疫組化ER、PR、HER-2、Ki-67，以及熒光原位雜交檢測結(jié)果等病理資料完整。非特殊型浸潤性癌75例,特殊亞型(包括篩狀癌、浸潤性小葉癌、黏液癌、伴神經(jīng)內(nèi)分泌癌特征的癌、化生性癌)16例,非特殊型浸潤性癌中Ⅰ級 2例,Ⅱ級31例,Ⅲ級58例。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性30例,陰性61例。所有患者均接受乳腺癌改良根治術(shù)或根治術(shù),術(shù)前均未行放化療和免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑

miRcute miRNA提取試劑盒(DP501)、TIANScript M-MLV(ER104-04)試劑盒,miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green,FP401)購于天根生化科技(北京)有限公司,所用引物的合成由生工生物公司合成。21-JH:UUGACUGUUGAAUCUCAUGGC,155-JH:UUUUUGCCUCCAACUGACUCCU,21-F1:TGTCGGGTAGCTTATCAGAC,155-F1: CTGTTAATGCTAATCGTGAT,T1:TGGTGTCGTGGAGTCG,U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACA,U6-R:AACGCTTCACGAATTTGC-GT。熒光定量儀購自于美國安捷倫公司,微量進(jìn)樣器購自于德國Eppendorf公司。

1.2.2 總RNA提取

從-80℃冰箱中取出保存的乳腺癌組織,碾碎后按天根miRcute miRNA提取試劑盒(DP501)進(jìn)行miRNA提取。采用微量熒光分光光度計測定提取液濃度以及260/280 nm處光密度(D)值,計算RNA濃度和純度后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄

按ER104-04試劑盒針對2個miRNA位點(diǎn),設(shè)計2條反轉(zhuǎn)錄引物:21-JH,155-JH,用天根TIANScript M-MLV(ER104-04)對提取好的miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,按以下步驟進(jìn)行以獲得cDNA:吸取2 μL反轉(zhuǎn)錄特異引物,50～500 ng mRNA,2 μL (10 mmol/L total) dNTPs(中性pH值),補(bǔ)滅菌蒸餾水至15 μL。PCR儀70℃加熱5 min后迅速在冰上冷卻2 min。簡短離心收集反應(yīng)液后加入4 μL 5×First-Strand Buffer(含有DTT),加入1 μL(200 U)TIANScript M-MLV并輕輕用移液器混勻。42℃溫浴50 min,95℃加熱5 min終止反應(yīng),用RNase-Free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到50 μL,取5 μL進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.4 RT-qPCR檢測miR-21及miR-155的表達(dá)

靶基因擴(kuò)增體系:AccuPower?Plus Dualstar qPCR Master Mix 15 μL、熒光染料1 μL、RNase-free ddH2O 5 μL、各自的上游引物2 μL、通用下游引物2 μL、cDNA鏈5 μL。以U6作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為95℃ 10 min,(95℃ 15 s,60℃ 1 min)40個循環(huán),25℃ 1 min,擴(kuò)增時做熔解曲線。根據(jù)PCR結(jié)果統(tǒng)計各個標(biāo)本miRNA表達(dá)Ct值和與之相對應(yīng)的內(nèi)參Ct值。

1.2.5 組織學(xué)類型、分級

參照2012年WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[5],分子亞型標(biāo)準(zhǔn)參照2013 St.Gallen 會議共識[6]

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用R統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究所有兩組因變量及其Box-Cox變換值均采用Shapiro-Wilk檢驗進(jìn)行正態(tài)性分布分析,對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)一步采用Fligner-Killeen檢驗進(jìn)行方差齊性分析。對符合正態(tài)分布及方差齊性的因變量Box-Cox變換值采用單因素方差分析,而非參數(shù)數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢驗進(jìn)行分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分子亞型采用Turkey HSD檢驗進(jìn)行進(jìn)一步多重比較。

2 結(jié)果

2.1 Box-Cox變換值與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

浸潤性乳腺癌中miR-21、miR-155的表達(dá)量Box-Cox變換值與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系,見表1。miR-21、miR-155相對表達(dá)量在腫瘤直徑>2 cm、組織級別Ⅲ級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和HER2陽性的病例均有顯著上調(diào),腫瘤在>2 cm與≤2 cm相比較(P=0.021),組織級別Ⅲ級與Ⅰ～Ⅱ級(P=0.045)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否陽性、HER2有否陽性相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。miR-155相對表達(dá)量在組織級別Ⅲ級與Ⅰ～Ⅱ級(P<0.001)相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,在腫瘤的大小、淋巴移轉(zhuǎn)移是否陽性、HER2有否陽性相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 miR-21、miR-155在浸潤性乳腺癌臨床病理指標(biāo)中差異性表達(dá)Tab.1 The differential expression of miR-21 and miR-155 in clinical pathological characteristics ofinvasive breast cancer (±s)

2.2 Box-Cox變換值與分子亞型間的關(guān)系

浸潤性乳腺癌中miR-21、miR-155表達(dá)量Box-Cox變換值與分子亞型間的關(guān)系,見表2。miR-21、miR-155的相對表達(dá)量在TNBC型、HER2型、Luminal B-like型均比Luminal A-like型顯著上調(diào),見表2。

miR-21表達(dá)量經(jīng)Box-Cox變換值在分子亞型中多重比較,HER2型與Luminal A-like型差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047)。miR-155相對表達(dá)量HER2型、TNBC型和Luminal B-like型分別與Luminal A-like型差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001),見圖1、2、3。

表2 miR-21、miR-155在浸潤性乳腺癌分子亞型中差異性表達(dá)Tab.2 The differential expression of miR-21 and miR-155 in molecular subtypes of invasive breast cancer (±s)

圖1 miR-21、miR-155的相對表達(dá)量在分子亞型中多重比較

圖2 miR-21表達(dá)量的Box-Cox變換值(相對表達(dá)量)

圖3 miR-155表達(dá)量的Box-Cox變換值(相對表達(dá)量)

2.3 參照WHO乳腺腫瘤分類

非特殊型浸潤性癌Ⅲ級HE染色形態(tài)，免疫組織化學(xué)染色HER2 3+形態(tài)，ER高表達(dá)和PR高表達(dá)形態(tài),見圖4。

3 討論

microRNA是一類長約19～23 nt的單鏈非編碼RNA,廣泛存在于植物和動物中。microRNA與其靶mRNA的3′-UTR(3′非編碼區(qū))特異性結(jié)合,引起靶mRNA的翻譯抑制或切割降解,調(diào)控基因的表達(dá),在細(xì)胞的生長、分化及死亡的過程中具有重要作用。

本研究顯示miR-21相對表達(dá)量在腫瘤>2 cm與≤2 cm相比較(P=0.021),組織級別Ⅲ級與Ⅰ～Ⅱ級(P=0.045)相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,這與Lee等[7]研究觀點(diǎn)一致。miR-155相對表達(dá)量在組織級別Ⅲ級與Ⅰ～Ⅱ級(P<0.001)相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與Chen等[8]研究結(jié)果一致。miR-21、miR-155相對表達(dá)量在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否陽性、HER2是否陽性差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義,與Lee等[7]一致。早期傅少梅等[9]的研究結(jié)果表明浸潤性乳腺癌病理學(xué)特征,如腫瘤大小、病理類型和分化、淋巴結(jié)情況、腫瘤分期、ER、PR及p53等,與miR-155和miR-21的表達(dá)量無明顯相關(guān)性；但他們認(rèn)為腫瘤組織HER2陽性患者miR-155的表達(dá)量高于HER2陰性患者的表達(dá)量。本研究也顯示miR-21、miR-155相對表達(dá)量在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和HER2陽性的病例均有上調(diào),但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，也可能與Lee等[7]認(rèn)為入組標(biāo)本數(shù)量不足是一致的。

圖4 WHO乳腺腫瘤分類中HE、HER2、ER、PR的表達(dá)

本研究顯示miR-21、miR-155的相對表達(dá)量在TNBC型、HER2型、Luminal B-like型均比Luminal A-like型顯著上調(diào)。miR-21相對表達(dá)量在HER2型與Luminal A-like型相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047)。Lee等[7]的研究也認(rèn)為miR-21相對表達(dá)量在HER2 型顯著上調(diào)的比例最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Liu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)在TNBC型miR-155相對表達(dá)量最高,其次依次是HER2型、Luminal B-like型和Luminal A-like型,相比較而言本研究HER2型相對表達(dá)量最高,這可能與有一定數(shù)量高分化TNBC型乳腺癌入組從而影響此分子亞型的相對表達(dá)量相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HER2型、TNBC型和Luminal B-like型miR-155相對表達(dá)量與Luminal A-like型差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001),并且相對表達(dá)量的差異明顯,可以作為鑒別診斷Luminal A-like型與TNBC型、HER2型、Luminal B-like型參考指標(biāo)。2015年St.Gallen會議共識對于TNBC型、HER2型以及HER2陽性的Luminal B-like型乳腺癌的劃分標(biāo)準(zhǔn),與相應(yīng)的治療方法基本沒有爭議,但在Luminal型患者中(Luminal A-like型、Luminal B-like型),對于該類亞型患者的治療選擇存在不同的意見,都希望盡量避免該亞型患者治療過度和治療不足。但調(diào)查顯示,對該亞型患者是否進(jìn)行化療的地區(qū)差異很大。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤miR-155相對表達(dá)量在Luminal B-like型顯著高于Luminal A-like型,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義,認(rèn)為可以通過檢測miR-155相對表達(dá)量避免采用多基因表達(dá)檢測技術(shù)，用來指導(dǎo)Luminal型乳腺癌患者是否需要行化療,并且價格也沒有多基因表達(dá)檢測技術(shù)昂貴,所以在大部分地區(qū)能夠?qū)嵤χ笇?dǎo)手術(shù)后Luminal型乳腺癌患者化療方案有一定的價值。

Nina等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-21的靶向治療可能對BRCA2突變攜帶者的治療有價值。Chang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)BRCA1基因可能直接抑制miR-155表達(dá)量,miR-155 可能成為治療BRCA1突變相關(guān)乳腺腫瘤的靶基因。 Kong等[13]的研究也發(fā)現(xiàn) miR-155在腫瘤血管生成中起著重要的作用,與TNBC型的乳腺癌發(fā)生相關(guān)。 這些有關(guān)miR-21和miR-155在乳腺癌分子機(jī)制方面的研究雖然還需要更多的研究來驗證,但可以為乳腺癌治療提供新的思路。

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