張志勇， 楊 潔， 齊澤民

(內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/四川省高等學(xué)校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點實驗室，四川內(nèi)江 641112)

川貝母(FritillariacirrhosaD.Don)為百合科貝母屬(FritillariaL.)多種植物的干燥鱗莖，為我國傳統(tǒng)可用于保健食品的名貴中藥材，有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消癰之功效。2015版《中華人民共和國藥典(一部)》收載的川貝母基原種為川貝母、暗紫貝母(F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia)、甘肅貝母(F.przewalskiiMaxim)、梭砂貝母(F.delavayiFranch)、太白貝母(F.taipaiensisP.Y.Li)或瓦布貝母[F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis(S. Y. Tang et S. C. Yue) Z. D. Liu，S. Wang et S. C. Chen]，按性狀不同分別習(xí)稱松貝、青貝、爐貝和栽培品[1-3]。川貝母主產(chǎn)于四川甘孜州、阿壩州及青海、甘肅和西藏交界地區(qū)，生長在山坡草叢或陰濕的小灌木叢中。川貝母由于生境特殊且種子休眠期長、自然萌發(fā)率低、野生資源過度采挖等原因而日趨瀕危。近年來，關(guān)于川貝母的研究進展迅速，在生理生態(tài)習(xí)性、藥用有效成分、藥理活性及其作用、種苗繁育與野外撫育、分子生物學(xué)研究等方面取得了較大突破，本文就相關(guān)方面的研究進行總結(jié)，旨在為川貝母的資源保護和合理開發(fā)利用提供一定參考。

1 生理生態(tài)習(xí)性

川貝母主要分布在海拔3 200～4 200 m的川西高原和青藏高原地區(qū)，高寒、高海拔是其生境的顯著特征。陳士林等根據(jù)川貝母分布的群落樣地相對優(yōu)勢度，應(yīng)用聚類分析方法劃分川貝母分布的群落類型[4]。通過對暗紫貝母適宜產(chǎn)地的分析發(fā)現(xiàn)，其分布區(qū)地勢具有高亢寒冷、日照強烈、空氣干燥、春秋短暫等特性[5]。陳文年等對貝母生長地融雪時間及海拔梯度的研究表明，暗紫貝母鱗莖平均單粒質(zhì)量隨著海拔的升高而降低；暗紫貝母的株高、單葉面積、地上生物量與生長地融雪時間關(guān)系密切，融雪時間對川貝母早期和中期物候階段影響較大，積雪晚融環(huán)境更利于川貝母的生長[6-7]。

川貝母種子在自然條件下休眠期長，出苗率低，出苗整齊度不理想，其原因在于種子有后熟過程，包括形態(tài)后熟和生理后熟2個階段，因此需要一定的低溫處理，才能完成后熟過程，解除休眠，促進發(fā)芽[8]。在對川貝母開花動態(tài)及授粉習(xí)性的研究中發(fā)現(xiàn)，川貝母自然異交率為81.9%，屬典型異花授粉植物[9]。在川貝母花期、果期噴施以磷、鉀無機元素為主，生長調(diào)節(jié)劑為輔的復(fù)合葉面肥和生長調(diào)節(jié)劑的復(fù)合型葉面肥，有利于提高川貝母的掛果率，從而促進川貝母的種子繁殖與人工栽培[10]。

2 川貝母的化學(xué)成分及其藥理作用

2.1 川貝母的化學(xué)成分

川貝母的主要有效成分為生物堿、皂苷和核苷等，且因其基源植物的不同而存在差異。余世春等利用光譜法在暗紫貝母干燥鱗莖中分離出異甾體生物堿等成分[11]。曹新偉等采用反復(fù)硅膠柱色譜法從川貝母的干燥鱗莖中分離純化出川貝酮、貝母乙素、貝母甲素等8種生物堿[12]。目前，在川貝母中分離并確定結(jié)構(gòu)的生物堿成分有100余個化合物[13]?？傮w上看，從川貝母中分離得到的生物堿成分主要有西貝素、貝母辛、松貝辛、川貝酮、松貝甲素、松貝乙素等[1]。利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法同時測定瓦布貝母鱗莖中的西貝母堿、貝母辛和貝母素乙等3種主要生物堿發(fā)現(xiàn)，瓦布貝母中的生物堿含量高于川貝母其他幾個基原種[14]。川貝母的莖、葉中同樣含有較高的生物堿類成分，并且野生川貝母莖和葉中的總生物堿含量均高于人工栽培種[15]。

川貝母中的非生物堿類成分也十分豐富，迄今從貝母屬分離到的非生物堿類成分有40多種，主要含有萜類、甾體、β-谷甾醇、油酸、硬脂酸、軟脂酸、嘌呤、嘧啶等[1，16-18]。王曙等用兩相滴定法和質(zhì)量法測定川貝母和其他貝母藥材中總生物堿含量和總皂苷含量發(fā)現(xiàn)，川貝母的總生物堿含量較浙貝母、伊貝母低，而總皂苷含量較高，說明不僅生物堿類成分能代表川貝母藥效特色，皂苷等其他成分也可以作為優(yōu)質(zhì)川貝母的評價指標(biāo)[19]。而川貝母新基原植物太白貝母中含有的紫外吸收水溶性成分主要是核苷類成分[20-22]。Cao等用HPLC-DAD法測定13種貝母類藥材中的核苷類成分含量，結(jié)果表明，以尿苷、鳥苷和腺苷為主的9類核苷類成分普遍存在于各種貝母藥材中，說明核苷類成分可作為貝母類藥材生物堿以外的活性成分[23]。Duan等進一步從川貝母水溶性提取物中定量分析鑒定了10種核苷和核堿基，并首次分離出2-脫氧腺苷和肌苷2種成分[24]。Peng等對不同生長期太白貝母9種核苷類成分的定量分析發(fā)現(xiàn)，尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和肌苷在2～4年生太白貝母中的含量顯著高于5～6年生，而胞苷、尿苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和腺苷的含量保持穩(wěn)定[25]。川貝母有效成分的差異可能源于內(nèi)生真菌的不同。通過比較不同生長期川貝母的內(nèi)生真菌發(fā)現(xiàn)，在類別和數(shù)量上存在著顯著差異，以3年生川貝母內(nèi)生真菌種類和數(shù)量最多[26]。內(nèi)生真菌能產(chǎn)生生理活性成分，如瓦布貝母的內(nèi)生真菌芬芳鐮刀菌6WBY3能產(chǎn)生貝母辛和西貝素-3β-D-葡萄糖苷[27]。

對同一產(chǎn)地不同川貝母基原植物中生物堿提取物的定性和定量分析表明，不同商品名稱的川貝母雖然成分上存在差異，但整體的化學(xué)成分組成相似、藥效也相近，可作為同一藥材使用[28]。

2.2 川貝母藥理作用

2.2.1 鎮(zhèn)咳祛痰作用 川貝母為傳統(tǒng)的止咳化痰良藥。李萍等對暗紫貝母等11種商品貝母進行的鎮(zhèn)咳藥理試驗表明，貝母的生物堿部分對小鼠氨水引咳有顯著的鎮(zhèn)咳作用[29]。孫濤等在研究川貝母止咳顆粒藥理作用的過程中發(fā)現(xiàn)，川貝母止咳顆粒對于動物模型的咳嗽潛伏期和降低咳嗽次數(shù)有不同程度的影響[30]。

黏稠的痰會造成呼吸道阻塞而感染，并刺激呼吸道引起咳嗽，川貝母可降低痰液黏稠度，同時對平滑肌有松弛作用，且川貝母中較高含量的皂苷可使小鼠呼吸道中的酚紅分泌物顯著增加，表明川貝母中皂苷可以成為祛痰的有效成分[29，31]。進一步研究表明，川貝母中的西貝素、西貝素β-氮氧化物、異浙貝甲素、異浙貝甲素β-氮氧化物等4種生物堿是鎮(zhèn)咳、化痰、消炎的主要有效成分[32-33]。周宜等通過分析不同基源川貝母品種的祛痰作用發(fā)現(xiàn)，暗紫貝母和梭砂貝母的止咳祛痰功效均優(yōu)于甘肅貝母[31]。川貝母新資源太白貝母同樣有明顯的止咳、祛痰作用，其效果與川貝母無明顯差異[34]。

2.2.2 平喘作用 哮喘是由于過敏原或其他非過敏因素引起的氣管和支氣管對各種刺激的反應(yīng)性增高而導(dǎo)致廣泛、可逆的氣道狹窄[13]，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，川貝母是防治復(fù)發(fā)性哮喘的首選中藥[35]。川貝母通過抑制Th2細胞因子、免疫球蛋白E和組胺的產(chǎn)生，減少嗜酸性粒細胞的積累、提高干擾素-γ的產(chǎn)生，從而起到平喘的作用[36]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，瓦布貝母、濃密貝母以及商品名為松貝等3種貝母均可以緩解反復(fù)接觸過敏原所引起的過敏性哮喘癥狀，發(fā)揮平喘的作用[37]。楊仕軍等對川貝母防治小鼠復(fù)發(fā)哮喘療效的研究結(jié)果表明，6種川貝母在相應(yīng)的作用環(huán)節(jié)上各有特色，其中暗紫貝母的總體效果最佳[35]。

2.2.3 抗癌作用 近來的研究表明，川貝母對治療子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等女性癌癥有良好的效果。川貝母的提取物能夠抑制子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β的信號傳導(dǎo)通路，從而抑制癌細胞的增殖[38]。同時，川貝母提取物能夠靶向NFKB基因，抑制卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖[39]。

2.2.4 抗菌消炎作用 川貝母醇提取物對格蘭氏陽性的葡萄球菌和格蘭氏陰性的卡它球菌具有抑制作用[40]。川貝母總生物堿提取液對金黃色葡萄球菌及糞腸球菌均有較明顯的抑制效果[41]。川貝母也具有良好的消炎作用，不同劑量的川貝母止嗽顆粒對急性炎癥及亞急性炎癥具有較好的抑制作用[42]。進一步研究表明，貝母中的西貝素和浙貝乙素能阻斷促炎介質(zhì)如NO的產(chǎn)生[43]。

此外，因含有多種生物活性成分，川貝母還具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗血小板凝集、抗?jié)?、抗缺氧和抗疲勞等功能，并且可以減輕脂質(zhì)過氧化和清除氧自由基，具有明顯的養(yǎng)生保健功效[1，35，44]。

3 種苗繁育

3.1 人工栽培

前人在川貝母人工育苗方面做了大量研究，但種子休眠周期長、發(fā)芽率低、出苗整齊度不理想等因素對種苗的繁育有較大阻礙。研究表明，川貝母種子休眠主要原因在于形態(tài)后熟和發(fā)芽抑制物的存在，是典型的混合型休眠，采用20～40 mg/kg 赤霉素對川貝母種子預(yù)處理32 h，能促進種子萌發(fā)，有效提高川貝母的出苗率和種苗整齊度[45]。通過層積處理也可打破種子休眠，其中25 ℃是發(fā)芽的適溫[8]。

Wu等對川貝母種子的含水量、吸水量和發(fā)芽率進行測定，并鑒定了川貝母種子的分級標(biāo)準(zhǔn)[46]。陳士林等根據(jù)川貝母的群落生態(tài)特征，在海拔4 000 m以上的原生地進行野生撫育研究，建立了野生撫育基地，促進了川貝母人工栽培的試驗和推廣[47]。川貝母經(jīng)腐殖土保濕儲藏促進種子后熟后的發(fā)芽率達83.6%，利用大棚設(shè)施栽培可以延長川貝母的生育期[48]。Hu等分別用川貝母種子和1年生鱗莖進行播種繁殖，結(jié)果表明，使用添加昆蟲糞便的腐殖質(zhì)進行種子繁殖效果更佳，而有無添加物均能促進1年生鱗莖的萌發(fā)和生長[49]。

3.2 組織培養(yǎng)

川貝母種子育苗周期長，難以滿足市場對貝母的需求。組織培養(yǎng)快速繁殖種苗不受季節(jié)限制，增殖系數(shù)高，因此研究人員在川貝母組織培養(yǎng)方面也進行了嘗試[50]。

3.2.1 外植體 川貝母組織培養(yǎng)選用的外植體一般用的是幼小鱗莖，另外川貝母葉和種子也可作為外植體。王躍華等分別以川貝母種子萌發(fā)出的針形幼苗、葉片、莖段和鱗片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，其中鱗片的誘導(dǎo)率最高[51]。李隆云等以不同生長發(fā)育期的暗紫貝母鱗莖為外置體誘導(dǎo)愈傷組織，其中1匹葉時期效果最佳，表明愈傷組織的誘導(dǎo)能力與外植體的生長發(fā)育時間密切相關(guān)[52]。以多倍體川貝母鱗莖芽為外植體誘導(dǎo)不定根，在35 ℃預(yù)脫毒處理后，選取生長狀況好的不定根切取其生長點區(qū)域進行培養(yǎng)，不僅愈傷組織誘導(dǎo)率高，而且脫毒效果好[53]。

3.2.2 培養(yǎng)條件 選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，因品種不同、外植體來源不同，選用的培養(yǎng)基也有所區(qū)別。王躍華等以卷葉貝母鱗莖愈傷組織的增殖量來比較MS、B5、White和SH等4種培養(yǎng)基的影響效果發(fā)現(xiàn)，MS基本培養(yǎng)基的愈傷組織增殖率最高，SH培養(yǎng)基的增殖率最低[54]。除基本培養(yǎng)基之外，外源激素[55]、蔗糖濃度[56]、溫度和光照等[54，57-58]培養(yǎng)條件也均對川貝母的生長有影響。

組織培養(yǎng)得到的鱗莖經(jīng)生藥鑒定，其藥理成分并未發(fā)生改變，且生物堿的含量較野生貝母資源高，說明利用組培技術(shù)對川貝母進行無性繁殖是切實可行的[59-61]。盡管如此，川貝母組織培養(yǎng)中仍存在一些亟待解決的問題，如川貝母鱗莖及種子均存在休眠現(xiàn)象，進行組織培養(yǎng)時須要首先采用物理或化學(xué)等方法破除休眠，易導(dǎo)致外植體材料發(fā)生褐化，此外使用鱗莖繁殖會消耗部分商品鱗莖。此外，川貝母的年生育期短，須要嚴(yán)格掌握好再生植株的馴化移栽時間，否則會影響植株的成活及鱗莖的發(fā)育。

4 川貝母分子生物學(xué)研究

4.1 分類鑒定

貝母屬植物種類繁多，根據(jù)中藥貝母基原植物劃分為川貝母、伊貝母、浙貝母、湖北貝母、平貝母和皖貝母等6個類型，川貝母是藥用價值最高的類群[62]。不同類型貝母從外觀上不易區(qū)分，但質(zhì)量和藥用價值差異明顯，因此市場上常出現(xiàn)以次充好的現(xiàn)象。從分子水平進行分類鑒定和遺傳多樣性分析，可以準(zhǔn)確區(qū)分川貝母及其混偽品。

徐傳林等采用PCR-RFLP分子鑒定法研究發(fā)現(xiàn)，川貝母核糖體DNA的ITS1區(qū)存在的特異性酶切位點，經(jīng)SmaⅠ酶切后有2條清晰的酶切條帶，而非川貝類均不能被酶切，該方法可簡便快速地對川貝母進行鑒定[63]。將PCR和RFLP技術(shù)相結(jié)合，目前已開發(fā)出適于川貝母快速檢測的DNA試劑盒，其鑒定結(jié)果與藥典法[64]完全一致。

利用PCR技術(shù)可以有效區(qū)分川貝母及其混偽品。Lee等設(shè)計特異引物進行熱不對稱PCR擴增，通過對5S rRNA間隔區(qū)域 16-mer特異序列的檢測，可以有效區(qū)分川貝母和浙貝母[65]。Li等通過設(shè)計引物擴增7種貝母的5S rRNA間隔區(qū)序列發(fā)現(xiàn)，在川貝母中能擴增出特異片段[66]。譚瑩等利用PCR對川貝母及其混偽品5S rDNA序列進行擴增，篩選出川貝母的特異性DNA指紋可作為川貝母及其混偽品快捷可靠的鑒定方法[67]。羅焜等利用DNA條形碼技術(shù)對10個川貝母不同基原植物及其常見混偽品的ITS2序列進行PCR擴增和測序，結(jié)果表明，川貝母及其混偽品的ITS2二級結(jié)構(gòu)存在明顯差異，聚類分析發(fā)現(xiàn)，川貝母不同基原物種聚為一支可以有效區(qū)分混偽品，為川貝母分類鑒定提供新的手段[68]。

4.2 基因克隆

川貝母是傳統(tǒng)的名貴藥食兩用中藥材，其有效成分主要是生物堿、皂苷等次生代謝物質(zhì)，且這些次生代謝物質(zhì)的合成途徑十分復(fù)雜。對川貝母基因組序列以及信號傳導(dǎo)途徑、次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因進行克隆和分析，有利于闡明川貝母有效成分合成的分子機制，為天然活性物質(zhì)的人工合成奠定基礎(chǔ)。

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，簡稱HMGR)是通過甲羥戊酸途徑合成生物堿的第1個限速酶，也是萜類化合物代謝的重要調(diào)控位點。謝紫瑩以暗紫貝母新鮮鱗莖為材料，利用RT-PCR獲得HMGR基因部分的特異性片段[69]。GF14蛋白是廣泛存在于植物中的參與細胞信號傳遞的調(diào)節(jié)蛋白，李玉峰采用RT-PCR結(jié)合cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，簡稱RACE)技術(shù)克隆獲得 1 133 bp 的GF14蛋白基因序列，分析表明，川貝母的氨基酸序列中有與其他GF14蛋白相似的酶活性位點[70]。通過單分子實時DNA測序(SMRT DNA sequencing)技術(shù)，Li等獲得了瓦布貝母的葉綠體基因組全序列，為貝母屬進化及分子鑒定的研究提供了重要資源[71]。

5 結(jié)語

川貝母藥用價值極高，但由于較長時期保護和發(fā)展的缺乏，以及生境的特殊，生態(tài)環(huán)境的破壞，導(dǎo)致近年來野生資源數(shù)量銳減。因川貝母的混偽品較多，其產(chǎn)業(yè)和市場仍然比較混亂。盡管研究者對川貝母的分類鑒定、藥用有效成分合成途徑等作了不少探索，但分子生物學(xué)等前沿性基礎(chǔ)研究在整體上仍相對滯后。今后應(yīng)在加強種質(zhì)資源保護的同時積極推進行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的貫徹落實，加大組織培養(yǎng)技術(shù)的攻關(guān)力度，打破川貝母的種子休眠，縮短培養(yǎng)周期，不斷完善野生撫育和人工栽培技術(shù)體系，實現(xiàn)川貝母的工廠化育苗與規(guī)?；a(chǎn)，以此解決川貝母資源短缺問題。此外，可通過加強川貝母的基礎(chǔ)研究工作，發(fā)掘優(yōu)良基因資源，加強分子育種技術(shù)研究，為川貝母產(chǎn)業(yè)發(fā)展探求新的道路。

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