沈清清，胡展育，劉 芳

（1.文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099；2. 文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

植物寄生線蟲是目前世界上分布最廣、對(duì)農(nóng)作物危害最重的害蟲，也是全世界植保界最關(guān)心、最不易解決的難題[1]。目前國際上線蟲的防治方法主要有物理防治法、化學(xué)藥劑防治法和農(nóng)業(yè)防治法。但是這些方法都存在著成本大、技術(shù)手段要求高等問題，特別是化學(xué)方法會(huì)造成很大的次生災(zāi)害，對(duì)其它生物的生長危害特別大。因此從安全生產(chǎn)和綠色環(huán)保的角度出發(fā)，生物防治法成為了實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要方法，其中尋找產(chǎn)毒真菌，從產(chǎn)毒真菌中分離具有殺線蟲效應(yīng)的活性物質(zhì)是一種具有很大發(fā)展?jié)摿Φ姆乐问侄?。Stirling G等[2]2004年報(bào)道從番茄根部分離獲得一株尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），該菌株能有效抑制南方根結(jié)線蟲對(duì)番茄的侵染，其抑制率達(dá)55%；Vu T等[3]2006年報(bào)道從香蕉上分離獲得一株鐮刀菌，該菌株能有效抑制香蕉穿孔線蟲（Radopholus similis）對(duì)香蕉的侵染，其抑制率高達(dá)85%；郝菲菲等[4]2015年報(bào)道從金線蓮中分離獲得的21株菌的殺松材線蟲活性均大于50%，其中一株阿姆斯特丹散囊菌 （Eurotiumam stelodami） 和一株竹生炭角菌 （Xylariabambusicola）的殺松材線蟲活性高達(dá)100%。鬼針草（Bidens pilosa）是一種入侵物種，由于瘦果冠毛芒狀具倒刺，可附著于人畜和貨物，目前廣泛分布于我國各地且危害嚴(yán)重[5]，開發(fā)及利用其優(yōu)勢是雙贏的治理手段。最近幾年科學(xué)家們從鬼針草的水提液及其包含的各化學(xué)成分方面進(jìn)行了大量的研究，但很少從其內(nèi)生真菌方面進(jìn)行研究。

本研究從鬼針草植株中分離到一株內(nèi)生真菌，以全齒復(fù)活線蟲為靶標(biāo)，對(duì)該內(nèi)生真菌的殺線作用進(jìn)行測定，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用鬼針草內(nèi)生真菌為生防菌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離材料來源

鬼針草健康植株采自文山市區(qū)內(nèi)。

1.1.2 供試線蟲

全齒復(fù)活線蟲（Panagrellus redivivus）由云南大學(xué)微生物資源開發(fā)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基的制備

采集鬼針草健康植株，清洗曬干后稱取莖葉300 g，剪碎后放入鍋中，加入1500 mL自來水熬煮30 min，后用紗布過濾熬煮好的汁液得到鬼針草濾液，稱取22.5 g蔗糖和瓊脂27 g，加入鬼針草濾液中，加熱直至瓊脂完全熔化，后定容至1500 mL，再次過濾，分裝，121℃高壓蒸汽滅菌。

1.1.4 供試線蟲的培養(yǎng)和制備

稱取5～8 g無糖燕麥片于250 mL錐形瓶中，用10～20 mL蒸餾水浸泡6～7 min，塞好棉塞后用報(bào)紙封口，121℃下滅菌30 min，無菌操作法把全齒復(fù)活線蟲接入燕麥片培養(yǎng)基。封口后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～10 d左右。觀察到有線蟲在錐形瓶壁上爬時(shí)，取出放置于冰箱中，調(diào)節(jié)溫度為4℃保存，備用。無菌操作條件下用貝曼氏漏斗法對(duì)線蟲進(jìn)行分離。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離

采集新鮮的鬼針草植株，洗凈，切成0.5 cm左右的小塊，用75%酒精處理1 min，然后用蒸餾水沖洗3次，2%的次氯酸鈉處理2 min，蒸餾水沖洗3次，將處理好的植株塊在無菌操作條件下接種到培養(yǎng)基上，密封，放入恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，恒溫箱28℃培養(yǎng)7 d后，觀察分析培養(yǎng)基上所生長的菌種，根據(jù)其菌落形態(tài)，顏色，質(zhì)地等情況初步判斷菌種差異，用PDA培養(yǎng)基對(duì)不同類型的真菌進(jìn)行純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鬼針草內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液的制備

純化后的菌種嚴(yán)格按照無菌操作接種在PDA液體培養(yǎng)基中，27℃、轉(zhuǎn)速200 rpm條件下置恒溫振蕩箱中培養(yǎng)4～5 d。

1.2.3 鬼針草真菌發(fā)酵粗提液對(duì)線蟲的抗性試驗(yàn)

真菌發(fā)酵液離心后稀釋，設(shè)6個(gè)濃度梯度（稀釋1、2、3、5、7、9倍）和對(duì)照，各三個(gè)重復(fù)，無菌操作條件下將各濃度稀釋液裝入培養(yǎng)皿中，對(duì)照組為無菌水。把清洗好的線蟲按每皿300條的方案加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)皿中。以上工作完成后分別在0.5、4、12、24、48 h這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。每個(gè)培養(yǎng)基觀察10個(gè)視野，把每個(gè)視野的死亡蟲數(shù)、以及10個(gè)視野死亡總蟲數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

判別線蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)為針觸法，即線蟲被發(fā)酵液處理后，針觸線蟲的活動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)線蟲呈僵直不動(dòng)時(shí)為死蟲，線蟲呈彎曲運(yùn)動(dòng)狀態(tài)為活蟲。有時(shí)線蟲和供試發(fā)酵液接觸后會(huì)呈假死狀態(tài)，其處理方法是將假死線蟲挑出置于培養(yǎng)皿中，加入少許2% NaCI浸泡5 min，僵直線蟲又呈運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，若5 min內(nèi)無反應(yīng)即可確定為個(gè)體死亡[6]。對(duì)殺線蟲活性強(qiáng)弱進(jìn)行分級(jí)：“－”表示校正死亡率≤10%，無殺線蟲活性；“＋”表示校正死亡率為10%～30%，殺線蟲活性弱；“＋＋”表示校正死亡率為30%～50%，殺線蟲活性中等；“＋＋＋”表示校正死亡率為50%～80%，殺線蟲活性較強(qiáng)；“＋＋＋＋”表示校正死亡率＞80%，殺線蟲活性強(qiáng)[7]。

線蟲死亡率:（死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)）×100%。

校正死亡率:［（處理組線蟲死亡率－對(duì)照組線蟲死亡率）/（1－對(duì)照組線蟲死亡率）］× 100%。

2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件和Microsoft Excel 2007對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為顯著差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)生真菌的分離

經(jīng)過分離和篩選，獲得并純化出一株供試菌株，編號(hào)為GF1。

3.2 菌株GF1發(fā)酵粗提液抗線蟲活性

表1為菌株GF1不同濃度的發(fā)酵粗提液對(duì)全齒復(fù)活線蟲的毒殺活性統(tǒng)計(jì)表，由表可知GF1菌株發(fā)酵粗提液各稀釋濃度作用0.5 h時(shí)對(duì)線蟲的毒殺活性未顯現(xiàn)，校正死亡率均小于5%，毒殺活性均為“－”；而發(fā)酵液原液在作用12、24、48 h時(shí)校正死亡率均高于90%，毒殺活性均為“++++”；稀釋9倍的發(fā)酵液在作用0.5、4、12 h時(shí)校正死亡率均低于5%，毒殺活性均為“－”，作用24 h后才表現(xiàn)出殺線蟲活性。由此可得菌株GF1發(fā)酵粗提液對(duì)線蟲的毒殺活性隨著濃度的升高而增強(qiáng)，而隨著作用時(shí)間的延長其毒殺活性也隨之提升。

表1 GF1菌株發(fā)酵粗提液抗線蟲活性

表2是GF1發(fā)酵粗提液時(shí)間與組別（濃度梯度）兩因素效應(yīng)表， 由表分析得知時(shí)間與組別（濃度梯度）兩組因素中，因?yàn)闀r(shí)間類型的平方和（73183.819）大于濃度的（44549.333），所以時(shí)間是主效應(yīng)。另外，從表中還可看出以時(shí)間為底F=83.39，P值等于0.000小于0.01所以在各時(shí)間段之間存在顯著差異。

表2 菌株GF1發(fā)酵粗提液時(shí)間與組別（濃度梯度）兩因素效應(yīng)

圖1是菌株GF1發(fā)酵粗提液不同濃度在不同時(shí)間段的殺線作用統(tǒng)計(jì)圖。表中數(shù)據(jù)顯示，不同稀釋濃度的發(fā)酵粗提液殺線作用效果存在明顯差異，且隨著濃度的增高殺線作用不斷增強(qiáng)，其中原液的效果非常顯著，作用線蟲僅12 h就能達(dá)到94%的致死率，為該菌作為生防制劑的開發(fā)提供了極為有利的數(shù)據(jù)支撐。稀釋2和3倍的濃度僅經(jīng)過12 h的作用對(duì)線蟲就能達(dá)到半致死效應(yīng)，而3～7倍的稀釋濃度經(jīng)過24 h的作用對(duì)線蟲也能達(dá)到半致死效應(yīng)，稀釋9倍時(shí)仍具有毒殺線蟲的效果，作用48 h后能達(dá)到半致死效應(yīng)。

以上結(jié)果表明該粗提液的作用效果非常明顯。測定作用12 h時(shí)發(fā)酵粗提液與全齒復(fù)活線蟲死亡關(guān)系得到回歸方程：y= 97.312x+ 7.6452，R2=0.8639。由此得出該發(fā)酵粗提液作用12 h時(shí)對(duì)全齒復(fù)活線蟲的半致死濃度LC50=0.435。

圖 1 菌株GF1發(fā)酵粗提液不同濃度在不同時(shí)間對(duì)線蟲的作用

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從鬼針草植株中篩選到一株內(nèi)生真菌即GF1菌株，其發(fā)酵粗提液對(duì)全齒復(fù)活線蟲的毒殺活性效果顯著，原液作用線蟲僅12 h就能達(dá)到94%的致死率，活性隨著濃度的升高而增強(qiáng)，隨著作用時(shí)間的延長毒殺活性也隨之提升，表明該菌作為生防菌株具有較高的開發(fā)價(jià)值，其研究數(shù)據(jù)為后續(xù)殺線活性物質(zhì)的分離奠定了基礎(chǔ)。

植物體內(nèi)存在著大量的內(nèi)生真菌，其存在的主要意義就是產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物以抵抗病蟲害對(duì)植物的侵染[8]，目前各國都在爭相研發(fā)和利用“環(huán)境和諧-相容農(nóng)藥”[9]，以實(shí)現(xiàn)國家的可持續(xù)發(fā)展，因此開發(fā)植物內(nèi)生真菌為生防菌種具有巨大價(jià)值和意義。菊科植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，其中具有殺線蟲活性的種類很多[9]，鬼針草屬菊科植物，張?zhí)熘萚10]2010年對(duì)鬼針草殺線活性進(jìn)行了測定，研究表明作用48 h后鬼針草提取物毒殺線蟲的校正死亡率達(dá)62.04%，其毒殺效果顯著，而本研究中從鬼針草分離獲得的GF1菌株同樣具有較強(qiáng)的殺線活性。內(nèi)生真菌與植物長期協(xié)同進(jìn)化過程中，可產(chǎn)生與其相同或相似的具有殺線活性次生代謝產(chǎn)物[1]，本文研究結(jié)果啟示我們可將菊科植物作為重要的材料資源，以獲得更多具有毒殺線蟲活性的內(nèi)生真菌。

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