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        蝴蝶蘭叢生芽組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

        2017-02-03 17:11:56陳和明呂復(fù)兵
        廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年10期
        關(guān)鍵詞:褐化花梗叢生

        黃 丹,陳和明,呂復(fù)兵

        (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640)

        蝴蝶蘭(Phalaenopsis)為蘭科蝴蝶蘭屬植物,原產(chǎn)于亞熱帶雨林地區(qū),本性喜暖畏寒,為附生性蘭花。其花型似蝶、色彩多樣、鮮艷多姿,花序好、花期長(zhǎng),廣受花卉愛(ài)好者的喜愛(ài),素有“蘭花皇后”的美稱,在全世界廣泛栽培[1]。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭,幾乎沒(méi)有側(cè)芽萌發(fā),不能通過(guò)分株方式進(jìn)行繁殖;同時(shí)蝴蝶蘭種子不含胚乳,自然條件下萌發(fā)率非常低,不能通過(guò)播種方式進(jìn)行繁殖[2]。因此,以上兩種繁殖方式均不能滿足市場(chǎng)對(duì)蝴蝶蘭的廣泛需求。

        目前,蝴蝶蘭的繁殖方法主要為無(wú)菌播種[3-4]和組織培養(yǎng)無(wú)性繁殖[5],無(wú)菌播種主要進(jìn)行雜交或自交獲得種子,經(jīng)過(guò)無(wú)菌播種得到實(shí)生苗,但實(shí)生苗分離大且變異多,不能保持親本的遺傳穩(wěn)定性,花色、花期多變等;利用莖、根、葉等外植體誘導(dǎo)原球莖進(jìn)行增殖并分化成苗,雖然性狀相對(duì)一致,但仍有較高的變異率,如花色不純等[6]。利用叢生芽進(jìn)行蝴蝶蘭繁殖是一種從芽到芽的增殖途徑,其優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)芽長(zhǎng)芽的方式使親本的遺傳穩(wěn)定,減少變異的發(fā)生,是最有效的快速繁殖方法[7-9]。因此,本文主要針對(duì)蝴蝶蘭叢生芽組織培養(yǎng)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,旨在為蝴蝶蘭種苗規(guī)?;a(chǎn)提供依據(jù)。

        1 外植體

        1.1 外植體的選取

        譚鵬鵬等[10]及尚楊娟等[11]以花梗為外植體,對(duì)花梗腋芽進(jìn)行了試驗(yàn)研究,結(jié)果表明:第2節(jié)、第3節(jié)花梗有較高的萌發(fā)率,以第3節(jié)萌發(fā)率最高;并得出花?;康牡?~3節(jié)誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)芽成功率較高,第4和第5節(jié)靠近頂端部分成為花芽的幾率大,這可能與芽的分化部位有關(guān),花梗基部的芽主要是休眠芽,在生長(zhǎng)激素的誘導(dǎo)刺激下容易發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)芽,但花序頂端的芽含有未完全分化的花原基,在培養(yǎng)基中比較容易誘導(dǎo)萌發(fā)為花芽[12]。劉亮等[8]在蝴蝶蘭叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)中也采用花梗腋芽作為外植體,將第一代誘導(dǎo)出來(lái)的新花梗芽作為叢生芽增殖的材料,增殖倍數(shù)可達(dá)5.5。

        1.2 外植體的消毒滅菌

        馬曉娟等[13]在蝴蝶蘭V31品種的花梗組培快繁中發(fā)現(xiàn),消毒時(shí)間對(duì)花梗腋芽的誘導(dǎo)率、褐化死亡率和污染率都有明顯影響,在0.1%氯化汞的條件下,消毒8 min的誘導(dǎo)率比消毒10 min的誘導(dǎo)率高出6.62%,且褐化率明顯偏低。付鎮(zhèn)芳等[14]在蝴蝶蘭大辣椒花梗組織快繁研究中發(fā)現(xiàn),消毒劑、消毒時(shí)間對(duì)外植體無(wú)菌處理至關(guān)重要,既要消毒干凈外植體,又不能損傷外植體的組織。其中花梗在次氯酸鈉消毒過(guò)程中,有大量細(xì)菌性、真菌性污染出現(xiàn),當(dāng)消毒20 min時(shí)污染減少,但用升汞消毒時(shí),隨著滅菌時(shí)間的增加,細(xì)菌性、真菌性污染逐漸減少,其中消毒10 min和15 min時(shí)最徹底,但消毒10 min的成活率高于15 min。然而,曾德華等[15]在滿天紅蝴蝶蘭花梗組培快繁中,用升汞消毒9~11 min時(shí),細(xì)菌性污染出現(xiàn)較多,當(dāng)消毒13~15 min時(shí),隨時(shí)間的增加,細(xì)菌性污染減少,成功率高達(dá)85%以上。

        2 叢生芽的誘導(dǎo)

        2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

        馬曉娟等[13]在蝴蝶蘭叢生芽快速繁殖體系中,在1/2MS和MS培養(yǎng)基中,1/2MS的誘導(dǎo)率比MS高出24.94%、褐化率也明顯比MS低,而MS培養(yǎng)基褐化嚴(yán)重且發(fā)生早,表明1/2MS培養(yǎng)基更有利于外植體的誘導(dǎo)。田甜[16]將蝴蝶蘭外植體分別接種在MS、KYOTO、1/2MS 3種培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn),1/2MS培養(yǎng)基萌發(fā)率最高。但武愛(ài)龍等[17]在蝴蝶蘭大辣椒組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究中,以花寶一號(hào)為基本培養(yǎng)基,誘導(dǎo)叢生芽的最佳配方為:花寶一號(hào)+NAA 0.3 mg/L+6-BA 5.0 mg/L。

        2.2 6-BA及NAA對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

        李金雨等[18]研究發(fā)現(xiàn),6-BA濃度在0.0~3.0 mg/L之間,隨著6-BA濃度的增加,蝴蝶蘭叢生芽的誘導(dǎo)率上升,且誘導(dǎo)時(shí)間縮短;但6-BA濃度在3.0~7.0 mg/L之間,隨著6-BA濃度的上升,其誘導(dǎo)時(shí)間逐漸縮短,但誘導(dǎo)率沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明當(dāng)6-BA濃度在3.0 mg/L以上時(shí),增加6-BA濃度對(duì)蝴蝶蘭叢生芽誘導(dǎo)率作用不大。因此,3.0 mg/L的6-BA對(duì)誘導(dǎo)蝴蝶蘭叢生芽是最適宜的。劉亮等[8]認(rèn)為在不添加NAA的條件下,隨著6-BA濃度的增加,誘導(dǎo)率上升且誘導(dǎo)時(shí)間縮短,當(dāng)6-BA 3.0mg/L時(shí),添加少量NAA誘導(dǎo)率達(dá)100%,因此6-BA和NAA組合使用效果較好。華海霞[19]也認(rèn)為NAA對(duì)芽的誘導(dǎo)影響不大,而6-BA的影響顯著,隨著6-BA濃度的上升,增殖系數(shù)變大,在6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L下效果最好。但張偉等[20]的試驗(yàn)認(rèn)為,在相同培養(yǎng)基的條件下,同時(shí)使用6-BA、NAA時(shí)誘導(dǎo)率比單獨(dú)使用6-BA時(shí)低,且培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng);當(dāng)6-BA的濃度達(dá)到5.0 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率略有下降且生長(zhǎng)較弱,表明高濃度的6-BA不適合蝴蝶蘭花梗側(cè)芽的誘導(dǎo),當(dāng)單獨(dú)使用6-BA且濃度在3.0 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率最高。

        3 叢生芽的增殖

        3.1 切割與擺放方式對(duì)叢生芽增殖的影響

        鐘海豐等[21]設(shè)置了6種不同的芽體物理切分與擺放方式,研究結(jié)果表明:芽體不同切分與擺放方式對(duì)蝴蝶蘭叢生芽增殖具有顯著影響。芽體切除生長(zhǎng)點(diǎn)后橫插,其單芽平均增殖率顯著高于其他處理,其中PSP-3(單芽切除生長(zhǎng)點(diǎn)后橫插)和PSP-6(雙芽切除生長(zhǎng)點(diǎn)后橫插)的單芽平均誘導(dǎo)芽數(shù)分別為6個(gè)和5.9個(gè),而常規(guī)單芽切除2/3葉片后豎插,其單芽平均誘導(dǎo)芽數(shù)僅為3.5個(gè)。但芽體損傷和芽體大小方面,不同處理的死亡率有所不同,單芽切除2/3葉片后縱切橫插的死亡率最高、達(dá)33.3%,單芽切除生長(zhǎng)點(diǎn)后橫插的死亡率次之、為23.3%。

        3.2 基本培養(yǎng)基對(duì)叢生芽增殖的影響

        付鎮(zhèn)芳等[14]利用蝴蝶蘭大辣椒對(duì)基本培養(yǎng)基的增殖情況進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明:不同基本培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭大辣椒的增殖有明顯不同的作用,其中MS培養(yǎng)基比1/2MS更有利于不定芽的增殖,增殖系數(shù)達(dá)2.35。但武愛(ài)龍等[17]在蝴蝶蘭大辣椒組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究中得出,利用花寶一號(hào)為基本培養(yǎng)基,叢生芽增殖和分化的最佳培養(yǎng)基為:花寶一號(hào)+NAA 0.2 mg/L +6-BA 6.0mg/L,增殖系數(shù)為5.53倍。同時(shí),在規(guī)模化種苗生產(chǎn)中,普遍利用花寶一號(hào)作為誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)基。

        3.3 6-BA對(duì)叢生芽增殖的影響

        在蝴蝶蘭叢生芽的增殖過(guò)程中,不同濃度的6-BA具有明顯影響。馬曉娟等[13]在試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),6-BA濃度為5.0 mg/L時(shí),叢生芽生長(zhǎng)健壯,且增殖率最高;當(dāng)6-BA處于1.0 mg/L低濃度時(shí)叢生芽增殖減少,當(dāng)濃度升高至5.0 mg/L增殖率逐漸上升,但6-BA濃度大于5.0 mg/L時(shí)增殖率隨濃度的上升而下降。李金雨等[18]認(rèn)為隨著6-BA濃度的上升,叢生芽的芽數(shù)增多,增殖率上升,各處理間差異達(dá)到極顯著,表明6-BA對(duì)蝴蝶蘭叢生芽的增殖具有決定性影響,其中濃度為6-BA 8.0 mg/L時(shí)增殖率最高、可達(dá)304%,且叢生芽生長(zhǎng)健壯,便于下一步的增殖及壯苗生根。當(dāng)6-BA濃度高于10.0 mg/L時(shí)增殖率逐漸上升,但叢生芽生長(zhǎng)較弱且有畸形芽出現(xiàn),不利于增殖。譚鵬鵬等[10]也認(rèn)為增加6-BA的濃度,增殖率隨之上升,當(dāng)6-BA濃度從5.0 mg/L上升到7.0 mg/L時(shí)增殖率達(dá)到最高,當(dāng)增加到10.0 mg/L時(shí)增殖率有所下降,表明高濃度的生長(zhǎng)激素抑制了芽的分化。

        3.4 6-BA及NAA對(duì)叢生芽增殖的影響

        譚鵬鵬等[10]認(rèn)為,在6-BA濃度相同、NAA濃度不同的條件下,其增殖系數(shù)有所不同,隨著NAA濃度的上升,增殖系數(shù)也相應(yīng)地增大,表明NAA對(duì)叢生芽的分化有促進(jìn)作用。華海霞[18]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),1.5~2.0 mg/L的6-BA有利于芽的增殖,濃度在2.0 mg/L時(shí)增殖效果最好;NAA對(duì)增殖作用不明顯,但低濃度的NAA具有協(xié)同作用[22],所以最佳增殖培養(yǎng)基為1/2MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。但楊海蕓等[23]和譚巍等[24]在NAA和IAA生長(zhǎng)素對(duì)蝴蝶蘭增殖的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),NAA要優(yōu)于IAA且濃度在0.5 mg/L時(shí),增殖率最高,在6-BA和KT兩種細(xì)胞分裂素中,6-BA優(yōu)于KT,在6-BA濃度為7.0 mg/L時(shí)增殖率最高。張偉等[20]也認(rèn)為NAA濃度在0.5 mg/L、6-BA濃度在1.0~7.0 mg/L時(shí),叢生芽增殖率逐漸提高,當(dāng)6-BA濃度為5.0 mg/L時(shí)增殖芽數(shù)較多且生長(zhǎng)強(qiáng)壯;但6-BA濃度達(dá)7.0 mg/L時(shí)增殖芽數(shù)最多,但有畸形芽出現(xiàn)。曾德華等[15]研究發(fā)現(xiàn),6-BA和NAA的最佳濃度為3.0 mg/L和0.5 mg/L或3.0 mg/L和1.0 mg/L時(shí),增殖效果最好。侯義龍等[25]在迷你蝴蝶蘭花梗側(cè)芽組織培養(yǎng)技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn),6-BA 8.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L最適宜叢生芽的增殖??梢?jiàn),6-BA濃度過(guò)高并不能達(dá)到最好的效果,唯有6-BA、NAA在配合使用且適宜濃度下,增殖效果最為理想。

        3.5 6-BA及其他激素對(duì)叢生芽增殖的影響

        楊錄軍等[26]在蝴蝶蘭新品種鄭農(nóng)火鳳凰的組培快繁研究中發(fā)現(xiàn),影響叢生芽增殖最大的因素是6-BA,其次是腺嘌呤,然后為CM,叢生芽在1/3MS + 6-BA 2.0 mg/L +腺嘌呤3.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L + CM 100 mL/L的培養(yǎng)基上增殖效果最好。漆子鈺等[27]在蝴蝶蘭小麻雀的組培快繁研究中發(fā)現(xiàn),6-BA 8.0 mg/L + 蛋白胨0.5 mg/L增殖率最高,表明低濃度的蛋白胨有促進(jìn)增殖的作用。然而,周全等[28]研究發(fā)現(xiàn),6-BA和TDZ兩種激素在蝴蝶蘭叢生芽增殖過(guò)程中,TDZ的增殖效果優(yōu)于6-BA,適于叢生芽增殖的培養(yǎng)基為1/3MS + TDZ 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖20 g/L + 瓊脂8.0 g/L + 活性炭2.0 g/L +CM 200 mL/L。

        4 壯苗生根

        在壯苗生根培養(yǎng)過(guò)程中,不同培養(yǎng)基的生根情況不同,其中NAA是關(guān)鍵。李金雨等[18]研究結(jié)果表明,MS + NAA 0.5 mg/L + 10%香蕉汁與MS + IBA 0.5 mg/L + 10%香蕉汁對(duì)生根的影響沒(méi)有差異,其它處理均達(dá)極顯著差異,其中以NAA 0.5 mg/L + 10%椰子汁的培養(yǎng)基對(duì)生根的效果最好,平均生根數(shù)達(dá)3.6條。同時(shí),試驗(yàn)結(jié)果還表明,椰子汁或香蕉汁等對(duì)生根有良好的促進(jìn)作用。劉亮等[8]將增殖芽轉(zhuǎn)入1/2MS + NAA 1.0 mg/L和1/2MS + IBA 0.3 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根試驗(yàn),結(jié)果表明兩種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)生根,但后者生根快,平均根數(shù)可達(dá)3.3條且生長(zhǎng)健壯。譚鵬鵬等[10]研究發(fā)現(xiàn),在生根階段,添加香蕉泥和活性炭對(duì)生根及壯苗有明顯促進(jìn)作用,香蕉泥對(duì)pH值有緩沖作用,并且含有天然的腺嘌呤等植物激素,有利于植物根系的生長(zhǎng)。馬曉娟等[13]發(fā)現(xiàn),椰汁、香蕉泥和土豆泥能明顯影響叢生芽增殖和分化,椰汁有利于增殖并促進(jìn)生根,且顯著優(yōu)于其他兩種處理,土豆泥能促進(jìn)根數(shù)和葉片數(shù)的增加。張啟香等[29]認(rèn)為,當(dāng)6-BA與NAA的配比適當(dāng)時(shí),蝴蝶蘭的生根較多,植株長(zhǎng)勢(shì)旺盛且健壯,其中6-BA具有細(xì)胞分裂與分化的作用,細(xì)胞分裂可以打破頂端優(yōu)勢(shì)的影響。鄭玉忠等[30]認(rèn)為壯苗生根對(duì)植株的移栽成活具有重要作用,因此應(yīng)篩選激素種類并找到適宜濃度。

        5 褐化防治

        張和等[31]認(rèn)為在蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的褐變不利于根的形成與生長(zhǎng),褐變是離體培養(yǎng)的無(wú)性系植物或進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí),從植物上切取時(shí)傷口所分泌出的酚類物質(zhì),在多酚氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變成醌類物質(zhì)所引起,且褐變率會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,并生成棕褐色的醌類物質(zhì),在培養(yǎng)基中逐漸擴(kuò)散,同時(shí)抑制酶的活性,毒害外植體。其中活性炭具有強(qiáng)大的吸附能力,能吸附非極性分子和色素等大分子,減少有害物質(zhì)的形成。王立婭等[32]發(fā)現(xiàn),1%活性炭能促進(jìn)生根,并能防止植物自身的酚類物質(zhì)排泌和變褐,對(duì)繁殖材料的形態(tài)發(fā)生和器官形成具有良好作用。除了活性炭能抑制Ca+的吸收和防止褐變外,檸檬酸、Vc等物質(zhì)對(duì)緩解褐化也有一定作用,而當(dāng)pH值在5.4~5.5時(shí),排的褐變物質(zhì)也相應(yīng)減少[31]。張偉等[20]發(fā)現(xiàn)添加30 mg/L檸檬酸能減少褐化且效果顯著,表明檸檬酸能有效降低褐化率、提高誘導(dǎo)率。但段文武等[33]在蝴蝶蘭組培的研究中發(fā)現(xiàn),顯著抑制褐化且對(duì)褐化影響最大的是活性炭,轉(zhuǎn)接周期對(duì)褐化的影響次之,對(duì)褐化影響從大到小分別為活性炭、轉(zhuǎn)接周期、溫度、椰子汁,其中活性炭1.0 g/L、轉(zhuǎn)接周期10 d、溫度25℃、椰子汁濃度150 mL/L,為抑制褐化的最優(yōu)組合。

        6 結(jié)論與展望

        對(duì)蝴蝶蘭叢生芽組織培養(yǎng)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,有利于更系統(tǒng)、更完整地了解當(dāng)前取得的水平和進(jìn)展情況,能夠更好、更快地為種苗生產(chǎn)提供借鑒和服務(wù)。綜合以上的分析,以花梗為外植體,通過(guò)花梗腋芽誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)芽成功率較高,其中第2節(jié)和第3節(jié)最好;外植體消毒滅菌時(shí),0.1%氯化汞消毒8~15 min比次氯酸鈉效果好,但不同品種的消毒時(shí)間略有差異。在叢生芽誘導(dǎo)中,以1/2MS或花寶一號(hào)為基本培養(yǎng)基,6-BA濃度在3.0~7.0 mg/L之間,或6-BA和NAA搭配可誘導(dǎo)出叢生芽;在增殖培養(yǎng)中,6-BA或TDZ對(duì)叢生芽增殖有明顯影響,NAA在適宜濃度下配合使用,增殖效果更佳,并以MS或花寶一號(hào)為基本培養(yǎng)基;在壯苗生根中,主要以低濃度的NAA或IBA,并配以椰子汁或香蕉汁、土豆汁等有機(jī)物對(duì)壯苗生根促進(jìn)作用明顯。在眾多防褐化因子中,活性炭能顯著抑制褐化且對(duì)褐化的影響最大,轉(zhuǎn)接周期對(duì)褐化的影響次之,對(duì)褐化影響從大到小分別為活性炭、轉(zhuǎn)接周期、溫度、椰子汁,其中活性炭1.0 g/L、轉(zhuǎn)接周期10 d、溫度25℃、椰子汁濃度150 mL/L為抑制褐化的最優(yōu)組合。

        雖然蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的研究目前已經(jīng)取得了相當(dāng)大的研究成果,但仍然存在一些問(wèn)題,特別是不同品種其消毒時(shí)間、誘導(dǎo)率、增殖率、轉(zhuǎn)接周期等均有差異,因此,需要更深入、細(xì)致地對(duì)不同類型的蝴蝶蘭進(jìn)行研究,找出適合自身的最佳消毒時(shí)間、培養(yǎng)基配方及轉(zhuǎn)接周期等,才能在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

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