唐納，趙光明，李征宇，張貴祥，王中領(lǐng)

磁共振分子成像是一種無(wú)創(chuàng)、具有高特異性的新型診斷方法，可從細(xì)胞、分子水平對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向顯像及診斷。葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)在很多惡性腫瘤中超表達(dá)，其表達(dá)方式有很強(qiáng)的基因及組織特異性，但是在正常細(xì)胞及組織中無(wú)表達(dá)[1-2]。作為非病毒載體，超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)因其具有超順磁性及低毒性的特點(diǎn)，在分子影像磁共振成像中被廣泛應(yīng)用。本研究制備葉酸(folate，F(xiàn)A)靶向的多功能納米復(fù)合物，研究其作用于人肝癌細(xì)胞Bel7402的細(xì)胞靶向性及應(yīng)用磁共振成像系統(tǒng)對(duì)其監(jiān)測(cè)的可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑

NP-DA-Dextra-FA葉酸靶向及非靶向NP-DADextran納米分子探針(蘇州大學(xué)化工學(xué)院與材料部提供)，多巴胺(Acros公司)，葡聚糖(上海滬峰公司)，葉酸(TCI公司)，人肝癌細(xì)胞Bel7402 (購(gòu)于上海生科院細(xì)胞庫(kù))，胎牛血清(杭州四季青公司)，葉酸DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，0.25%胰酶(Sigma公司)。

1.2 主要設(shè)備

C O2培養(yǎng)箱(德國(guó)H e r a b u s公司)，F(xiàn) E I TecnaiG220透射電子顯微鏡，GE signa HDx 3.0 T磁共振成像系統(tǒng)， Jjouan MR23i低溫高速離心機(jī)，NikonYS100倒置相差顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4和Fe3O4-NPs的合成[1]

油酸鈉(9.125 g，30 mmol)、FeCl3?6H2O(2.7 g，10 mmol)倒入正己烷(35 mL)、去離子水(15 mL)、乙醇(20 mL)混合物中，經(jīng)4 h反應(yīng)(70 ℃)后分離紅褐色含油酸鐵的正己烷混合物，用去離子水3次洗滌后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除正己烷，獲得含油酸鐵的油狀混合物。取含油酸鐵的混合物(9 g，10 mmol)加入油酸(1.41 g，5 mmol)、十八碳烯(25 g)，在N2條件下，升溫到320℃隨后攪拌30 min。接著沉淀、離心，并用正己烷和乙醇洗滌3次，分散于正己烷中。取10 mL N,N-二甲基甲酰胺，將Fe3O4(100 mg) 分散其內(nèi)，之后加入鹽酸多巴胺(200 mg) (N,N-二甲基甲酰胺20 mL)溶液，超聲20 min后攪拌12 h。然后經(jīng)過(guò)葡聚糖的活化、連接葡聚糖及葉酸的活化一系列反應(yīng)制作的產(chǎn)物備用。所得納米分子探針進(jìn)行一系列表征測(cè)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞Bel7402接種于含10%胎牛血清的無(wú)葉酸DMEM培養(yǎng)基中隨后放在培養(yǎng)箱內(nèi)以37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)，待貼壁的H460細(xì)胞密度生長(zhǎng)至90%時(shí)，去除原培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，每3 d傳一代。在培養(yǎng)過(guò)程中用光學(xué)顯微鏡對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。待細(xì)胞生長(zhǎng)總數(shù)達(dá)1×107個(gè)時(shí)停止傳代備用。

1.3.3 普魯士藍(lán)染色

將人肝癌細(xì)胞Bel7402的靶向及非靶向分子探針行普魯士藍(lán)染色。將1×106個(gè)的Bel7402細(xì)胞分別與鐵濃度為40 μg/ml的葉酸靶向與非靶向分子探針在無(wú)葉酸DMEM培養(yǎng)液中孵育2 h后(置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中)，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，用4%戊二酮固定20 min后，蒸餾水洗3次，核固紅復(fù)染3 min后，蒸餾水洗滌3次，隨后在顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)鐵染色效果。

1.3.4 競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)

將數(shù)量為1×106的人肝癌細(xì)胞Bel7402與不同濃度(0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L)的游離FA孵育1 h后，再與鐵濃度為40 μg/ml的FA納米靶向探針孵育1 h后，行MR體外成像。

1.3.5 體外磁共振成像

將人肝癌細(xì)胞Bel7402接種在6孔板內(nèi)，分別與鐵濃度為0 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml的FA靶向與非靶向納米分子探針與1×106的人肝癌細(xì)胞孵育2 h，用PBS液沖洗3次，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化后重懸于0.5 ml 1%瓊脂糖的EP管中。(1)成像方法：應(yīng)用3.0 T MR掃描儀進(jìn)行懸浮細(xì)胞成像，采用動(dòng)物小線圈。掃描參數(shù)：采用快速自旋轉(zhuǎn)回波(fast spin echo，F(xiàn)SE)序列：TR/TE=4240 ms/108 ms；層厚=2 mm；層間距=1 mm；矩陣=256×256；FOV=8 cm×8 cm；T2 mapping掃描，采用多回波SE序列，共采集8回波，TR 1500 ms，TE 9.4 ms、18.7 ms、28.1 ms、37.4 ms、46.8 ms、56.1 ms、65.5 ms、74.8 ms，層厚2 mm；層間距1 mm；矩陣=256×256；FOV=8 cm×8 cm。(2)成像分析：選擇測(cè)量面積大于30 mm2的感興趣區(qū)(region of interest，ROI)測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度和R2值，保持測(cè)量在同一橫斷面，每組樣本含量保持一致，同一樣品重復(fù)6次測(cè)量，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0軟件包，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。T2磁共振信號(hào)強(qiáng)度分析運(yùn)用One-way ANOVA單因素方差分析，兩兩比較運(yùn)用SNK及LSD檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NP-DA-Dextra-FA葉酸靶向納米復(fù)合物的制備和表征

SPIO和FA連接成功，分子靶向納米探針呈現(xiàn)出特異性的苯環(huán)峰值(圖1)，峰值約2650 cm-1；粒徑在透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)下測(cè)得約14 nm。經(jīng)TEM觀察，分子納米探針分布均勻、形態(tài)規(guī)則。

2.2 普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

NP-DA-Dextra-FA葉酸靶向納米分子探針(40 μg/mL)同人肝癌細(xì)胞Bel7402孵育后，肝癌細(xì)胞內(nèi)可觀察到大量鐵顆粒沉積；FA非靶向NP-DA-Dextran納米分子探針(濃度40 μg/mL)與Bel7402細(xì)胞孵育后，內(nèi)僅見少量鐵顆粒沉積(圖2)。

2.3 體外競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)

隨著細(xì)胞培養(yǎng)基中游離FA濃度從0 mmol/L增高到2.0 mmol/L時(shí)，Bel7402肝癌細(xì)胞的T2信號(hào)強(qiáng)度隨著游離FA濃度增高而逐漸變亮(圖3)。

2.4 MR 體外成像結(jié)果

鐵濃度為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的葉酸靶向NP-DA-Dextra-FA復(fù)合物和非靶向NP-DA-Dextran納米分子探針分別與人肝癌Bel7402細(xì)胞孵育2 h后，靶向組細(xì)胞T2信號(hào)強(qiáng)度隨鐵濃度的升高顯著降低，非靶向組細(xì)胞T2信號(hào)強(qiáng)度下降相對(duì)不顯著(圖4A)。T2 maping序列顯示R2值隨著鐵濃度的升高顯著升高，非靶向組細(xì)胞的R2值升高相對(duì)不顯著(圖4B)，兩組R2值分別為圖4B (a)依次測(cè)量為1.38×10-2ms-1、1.64×10-2ms-1、1.76×10-2ms-1、2.22×10-2ms-1、2.50×10-2ms-1、4.96×10-2ms-1；圖4B (b)依次測(cè)量為1.42×10-2ms-1、17.11×10-2ms-1、27.51×10-2ms-1、7.33×10-2ms-1、12.34×10-2ms-1、20.08×10-2ms-1。

2.5 信號(hào)強(qiáng)度變化、信號(hào)強(qiáng)度變化率與濃度間的關(guān)系

FA靶向NP-DA-Dextra-FA納米分子探針和非靶向NP-DPA-Dextran納米分子探針分別與人肝癌細(xì)胞Bel7402孵育后，F(xiàn)A靶向NP-DA-Dextra-FA分子探針組腫瘤細(xì)胞MR信號(hào)強(qiáng)度隨著鐵濃度的升高明顯降低，而非靶向NP-DA-Dextran納米分子探針組降低相對(duì)不顯著。在濃度80 μg/mL時(shí)，兩組的信號(hào)強(qiáng)度下降率分別為89.67%及37.92%，靶向組的信號(hào)強(qiáng)度變化率約為非靶向組的2～3倍，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) (圖4C，表1)。

3 討論

葉酸作為一種B族天然維生素，在人體一碳單位代謝過(guò)程中有著極為重要的意義。葉酸受體在肝癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌及結(jié)腸癌等[1-6]絕大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)或超表達(dá)，具有很強(qiáng)的組織特異性，在正常組織細(xì)胞中不表達(dá)或呈低表達(dá)。超順磁性氧化鐵具有明顯的T2負(fù)超順磁效應(yīng)，在肝、脾等器官磁共振成像中常作為一種理想的對(duì)比被廣泛應(yīng)用。FA具有價(jià)格低廉、低免疫源性等優(yōu)點(diǎn)，在臨床中較為常用，F(xiàn)R介導(dǎo)的靶向成像及給藥成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[7-10]。以葉酸為載體，通過(guò)FR受體介導(dǎo)，可以將超順磁性氧化鐵帶至腫瘤細(xì)胞表面，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后攝入細(xì)胞胞漿，從而縮短腫瘤T2弛豫時(shí)間，對(duì)藥物的釋放監(jiān)測(cè)及提高腫瘤診斷敏感性具有重要價(jià)值，以實(shí)現(xiàn)MRI對(duì)腫瘤治療監(jiān)測(cè)的可視化。

此研究運(yùn)用對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel7402與葉酸靶向及非靶向分子探針進(jìn)行孵育，通過(guò)比較由于人肝癌細(xì)胞Bel7402對(duì)靶向分子納米探針攝取的差別而導(dǎo)致的磁共振信號(hào)強(qiáng)度差異，由細(xì)胞、體外分子水平來(lái)研究MR成像儀對(duì)腫瘤靶向成像和監(jiān)測(cè)的可能性。FA具有靶向效應(yīng)，主要表現(xiàn)在位點(diǎn)特異性、配體介導(dǎo)的納米分子探針在腫瘤細(xì)胞中的聚集。本研究自行設(shè)計(jì)的FA靶向納米分子探針，并利用非靶向納米探針作為對(duì)照組，在細(xì)胞水平去探討FA靶向納米分子探針對(duì)FR表達(dá)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞的靶向效應(yīng)。本研究中將不同濃度的FA靶向、非靶向分子探針與肝癌細(xì)胞孵育2 h后，通過(guò)MR T2成像、T2 mapping成像及普魯士藍(lán)染色觀察兩種分子探針與Bel7402細(xì)胞內(nèi)攝的情況，初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向組的腫瘤細(xì)胞的攝取率比非靶向組明顯高，靶向組T2馳豫時(shí)間比非靶向組明顯減低，這表明由葉酸介導(dǎo)的納米分子靶向探針對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel7402靶向效應(yīng)明顯，普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人肝癌細(xì)胞Bel7402靶向組鐵顆粒含量明顯比非靶向組高。在體外競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果進(jìn)一步表明了FA修飾的納米分子探針對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向攝取主要依賴于FR。

NP-DA-Dextran-FA納米分子探針是一種靶向?qū)Ρ葎嗑哂幸欢ǖ奶禺愋?，其靶向效?yīng)的機(jī)制可能為以下幾種。(1) FR受體與FA特異性結(jié)合，隨后將分子靶向納米探針帶至腫瘤細(xì)胞的表面，來(lái)減低腫瘤的T2信號(hào)強(qiáng)度。(2)細(xì)胞外的葉酸被瘤細(xì)胞表面的葉酸受體介導(dǎo)，經(jīng)過(guò)內(nèi)化途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致瘤細(xì)胞T2信號(hào)減低，這是葉酸進(jìn)入瘤細(xì)胞內(nèi)的重要途徑[11]。(3)磷脂酶C裂解瘤細(xì)胞表面的葉酸受體后，使瘤細(xì)胞間隙內(nèi)的葉酸受體明顯聚集，故使瘤細(xì)胞間隙內(nèi)分子納米探針靶向聚集[12]。這幾種機(jī)制可對(duì)腫瘤內(nèi)分子靶向探針長(zhǎng)時(shí)間聚集及其特異性給予了恰當(dāng)?shù)慕忉尅?/p>

圖1 NP-DA-Dextra-FA納米分子探針紅外光譜圖，紅外峰值約為2650 cm-1Fig.1 The infrared spectrogram of NP-DA-Dextra-FA nanoparticles probe,the infrared peak is 2650 cm-1

圖2 普魯士藍(lán)染色圖。A：葉酸靶向NP-DA-Dextra-FA分子探針；B：非靶向NP-DA-Dextran分子探針普魯士藍(lán)染色圖Fig.2 Prussian blue staining. A: Folate-targeted NP-DA-Dextra-FA nanoparticles probe; B: Non targeting NP-DA-Dextran.

圖3 體外競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)圖Fig.3 Competitive inhibition experiment in vitro

圖4 FA非靶向納米與靶向納米分子探針MR信號(hào)強(qiáng)度的改變及T2馳豫時(shí)間的改變Fig.4 The change of signal strength of folate-targeted NP-DA-Dextra-FA and non targeting NP-DA-Dextran nanoparticles probe

表1 不同鐵濃度葉酸靶向?qū)Ρ葎┘胺前邢驅(qū)Ρ葎┡cBel7402 MR孵育后信號(hào)強(qiáng)度變化Tab.1 The change of signal strength of different concentrations of iron folic acid targeted contrast agent and the targeted contrast agent incubation with Bel7402 cells

SPIO在MR成像、熱療中得到廣泛的應(yīng)用，和非聚合的Gd聚合物對(duì)比劑相比較，SPIO呈現(xiàn)更高的靈敏度。通常其表面被用葡聚糖、PEI及樹枝狀大分子等衍生物修飾，使其具有更好的生物相容性及穩(wěn)定性[13]。以提高對(duì)比劑的水溶性及分散性。而未經(jīng)任何修飾的SPIO，其表面帶有負(fù)電荷，很難被同樣帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜所攝取。此研究的超順磁性氧化鐵與多巴胺、葡聚糖相連并通過(guò)修飾后，粒徑大小為14 nm，完全符合MR對(duì)比劑的基本條件。本研究課題組研制的FA分子靶向探針因其有低毒性及良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用前景極為廣泛。

葉酸受體介導(dǎo)的磁性納米分子探針可同時(shí)用作MR靶向?qū)Ρ葎?，及運(yùn)送藥物的載體，通過(guò)其介導(dǎo)的分子靶向納米探針連接抗腫瘤藥來(lái)靶向治療腫瘤并行磁共振成像監(jiān)測(cè)已是此領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較多局限于腫瘤細(xì)胞分子靶向攝取機(jī)制，但是尚面臨瘤細(xì)胞對(duì)特定納米分子靶向探針的特異性識(shí)別及靶向藥物在瘤內(nèi)有效釋放等問(wèn)題，這將成為此領(lǐng)域的焦點(diǎn)問(wèn)題，同時(shí)也面臨著巨大的挑戰(zhàn)[14]。

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