吳鎖連，康懷彬， 李冬姣，張云霞，朱鏑融

動物食品中磺胺類藥物殘留的分析方法

吳鎖連1，康懷彬2， 李冬姣1，張云霞1，朱鏑融1

（1.鄂州職業(yè)大學醫(yī)學院，湖北鄂州 436000；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471000）

磺胺類藥物因價廉及抗菌譜廣，主要用于動物飼料或治療藥物，但是不合理用藥會導致磺胺類藥物在動物組織中殘留，影響食品安全，從而損害人類健康，因此對動物性食品的磺胺類藥物殘留檢測十分必要。通過綜述磺胺類藥物殘留的樣品前處理及各種分析方法、適用范圍等，為其檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

動物食品；磺胺藥物殘留；樣品處理；分析方法

0 引言

磺胺類藥物（SAs）是以對位氨基苯磺酰胺為基本結(jié)構(gòu)的衍生物，具有抗菌譜廣、價廉穩(wěn)定的特點，當和甲氧芐嘧啶、二甲氧芐嘧啶等抗菌增效劑協(xié)同使用，其抗菌譜擴大、活性提高，從抑菌變成殺菌作用，因此廣泛應(yīng)用于臨床動物、水產(chǎn)養(yǎng)殖及飼料添加劑等研究領(lǐng)域[1]。

1 磺胺藥物殘留

從2005年起，農(nóng)業(yè)部對動物產(chǎn)品的SAs殘留予以重點監(jiān)控。SAs被動物體吸收后，可轉(zhuǎn)移到肉、蛋和乳等食品中，再通過食物鏈對人體產(chǎn)生副作用，主要表現(xiàn)在致癌、致畸、致突變等方面，王津濤等人[2]發(fā)現(xiàn)磺胺二甲嘧啶（SM2）在小白鼠連續(xù)給藥中，會誘發(fā)甲狀腺濾細胞腺癌，而且藥物殘留還會引起生態(tài)環(huán)境的污染，防礙畜牧業(yè)的發(fā)展。歐美大多數(shù)國家和我國規(guī)定動物源性食品中SAs的限定為總量不得大于 100 μg/kg[3]，日本為 20 μg/kg[4]。因此，對食品安全監(jiān)測技術(shù)的研究提出要求，出現(xiàn)許多SAs測定方法。

2 樣品前處理

樣品檢測前，需要將待測組分分離出來，避免樣品中其他組分對目標分析物的干擾及對色譜儀的損害。早期樣品前處理多采用液相萃取法，但是操作繁瑣，且對于樣品較復雜的水產(chǎn)品，僅用液相萃取難以去除其他干擾成分，液相萃取使用的一些有機溶劑也會影響動物蛋白活性，因此出現(xiàn)了新的萃取方法。

2.1 固相萃取

固相萃?。⊿PE）是由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)聯(lián)合發(fā)展，采用固體吸附劑選擇性吸附目標化合物，再經(jīng)洗脫達到分離、富集的作用，固相萃取簡單快速、溶劑量少，但選擇性不強，易將干擾物一同萃取。固相萃取仍是當前藥物殘留前處理的主要方法。常用的SPE柱有堿性氧化鋁柱，Sep-Pak C18，Sep-Pak硅土柱，Bond Elut PSA柱，HLB柱，以及各種陽離子交換柱如MCX3，SXC，WCX等。吳黎明等人[5]采用Oasis HLB柱凈化，高效液相色譜熒光法檢測蜂王漿中8種SAs殘留，最低檢測限為10～50 μg/kg，回收率在 62.3%～74.8%。有學者對固相萃取方法進行改進，縮短了樣品前處理時間，鄔晨陽等人[6]采用C18柱凈化，高效液相色譜（HPLC）法測定牛奶中7種SAs，檢出限為1.3 μg/L，平均回收率為88.56%～91.65%。

2.2 基質(zhì)固相分散技術(shù)

基質(zhì)固相分散技術(shù)（MSPD） 是由美國的Barker S A等人[7]提出并闡明理論的一種萃取方法，將樣品與C18柱填料混勻裝柱，經(jīng)洗脫后，將高極性雜質(zhì)留在柱內(nèi)。

與傳統(tǒng)樣品處理方法相比，MSPD具有省時、無乳化、樣品和溶劑用量少等優(yōu)點。MSPD適用于多種獸藥殘留分析，耿志明等人[8]采用基質(zhì)固相分散技術(shù)提取凈化，高效液相色譜（HPLC）測定魚肉組織中7種SAs殘留，檢測限為0.02～0.03 mg/kg；Kishida Kunihiro等人[9]改進了MSPD法，采用中性氧化鋁作為固相分散劑，HPLC法測定雞肉中SM2等6種SAs殘留，回收率大于87.6%。最低檢測限6～40 ng/g，且檢測時間小于1.5 h，溶劑12 mL。

2.3 超臨界流體萃取

超臨界流體萃?。⊿FE）是以超臨界狀態(tài)下的流體為溶劑，從樣品中萃取出可溶性目標化合物的過程。美國通用食品公司最早將SFE技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)，Robert J等人[10]采用SFE萃取3種SAs含量，優(yōu)化后條件為40℃，68 MPa，二氧化碳濃度1.042 g/mL，流速 2.5～2.71 L/min，持續(xù) 40 min，回收率 71.6%～96.9%。SFE具有快速高效、溶劑量少的優(yōu)點，但設(shè)備昂貴，且無法適用于水樣樣品分析。

2.4 免疫親和色譜法

免疫親和色譜（IAC）是將抗體固定在載體基質(zhì)上，通過抗體對抗原性物質(zhì)的結(jié)合，進行分離純化，純化的樣品可直接用于理化分析或免疫檢測，而且IAC柱能再生。Jun Suo Li等人[11]采用IAC凈化，HPLC/UVD測定了豬肉中的磺胺，檢測限為0.001 μg/g。IAC是當前凈化和富集能效最好的方法，但是非特異性吸附和大量純化抗體的獲取制約了該技術(shù)的進一步發(fā)展。

2.5 微波輔助萃取

微波輔助萃?。∕AE）采用微波加熱溶劑，將待測物從樣品中分離并溶入溶劑中。通過微波加熱強化，樣品萃取的速度、效率和質(zhì)量都有所提高。盧立泓等人[12]采用MAE凈化，RP-HPLC測定鰻魚中SAs殘留，優(yōu)化條件為45℃，5 min，800 W，采用微波萃取省時高效，且精密度、重復性和回收率也達到常規(guī)萃取法的要求。

3 分析方法

動物性食品中SAs的檢測方法經(jīng)過不斷的研究和改進，目前主要分為微生物學法、免疫法及理化檢測方法。

3.1 微生物學法

微生物學法是通過SAs對特異微生物生理機能和代謝的抑制性，從而對樣品中SAs殘留進行分析。檢測方法包括四平皿法、拭子法、紙片法和Charm檢測法?，F(xiàn)已有商品化試劑盒ECLIPSE 50Delvotest SPKit，CopanTest（CHATK），CharmFarmTest，Charm AIM-96等。Braham R等人[13]采用對磺胺類藥物敏感的嗜熱脂肪芽孢桿菌接種到含溴甲酚紫和甲氧芐氨嘧啶的瓊脂中，通過瓊脂顏色和微生物生長抑制區(qū)來判定SAs含量，檢測限接近最高殘留量。微生物學法簡便價廉，可用于大批樣品分析，但是菌種不易篩選，易受抗生素干擾、特異性較差，不易定性或定量，無法滿足微量抗微生物藥殘留的檢測。

3.2 免疫分析法

免疫分析法起步于20世紀80年代，目標待測物與抗體結(jié)合的一種檢測技術(shù)，常用的是酶聯(lián)免疫吸附法，隨著免疫相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，生物傳感技術(shù)、放射性同位素標記、表面等離子共振等分析化學技術(shù)與免疫技術(shù)相融合，產(chǎn)生的新的SAs殘留免疫分析方法。

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 是SAs殘留免疫分析的主要方法，占90%以上[14]，在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，是采用酶標記技術(shù)與抗原抗體特異性結(jié)合的一種分析方法，根據(jù)酶催化底物的顏色來定量或定性。與高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用的理化分析結(jié)果接近，且操作相對簡便，適合于現(xiàn)場和大批量樣品的篩選分析，還可直接用于尿液、血液分析。楊紅[15]用兔抗SM2抗血清測定牛奶、豬血漿和豬尿中SM2的酶聯(lián)免疫吸附法，最低檢出限為0.025 μg/L。我國在“十五”科技攻關(guān)期間自主研發(fā)了ELISA試劑盒，檢測限10 μg/kg左右，達到國外同類產(chǎn)品水平。市場上有商品化的試劑盒，如Randox Sulfaquinoxline ELISA，Randox Sulfadiazine ELISA，Qflex Kit，Editek/Diagnostix Sulfaquinoxline Single Step ELISA等，但還沒有研制出檢測多種磺胺類藥物殘留的試劑盒。ELISA應(yīng)用廣泛，但酶不穩(wěn)定、測定范圍窄、難以完全自動化、檢測時間較長等缺點也限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

3.2.2 放射免疫分析法

放射免疫法（RIA） 是最早建立的免疫分析方法，是將同位素標記技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的一種檢測方法，主要用于SAs總殘留量的檢測。國外開發(fā)了一系列放射免疫試劑盒，美國Charm公司開發(fā)的Charm II和Charm II Sulfa Drug Test Kit應(yīng)用最為廣泛。林杰等人[16]參考Charm公司的資料，采用Charm II放射免疫法測定飼料中的SAs殘留，檢測限為100 μg/kg，60 min得出分析結(jié)果。此法提取簡便快速、靈敏度高、檢測限量低，可廣泛用于藥物、激素、細胞因子等化合物的定量分析中，但是由于其需要嚴格的放射性廢物處理手段和特殊的實驗室要求，限制了其進一步的發(fā)展。

3.2.3 膠體金免疫層析分析法

膠體金免疫層析分析法（GICA） 是在20世紀90年代發(fā)展起來的，采用膠體金顆粒作為標記物，運用于抗原抗體反應(yīng)中，通過標記物聚集形成紅色或粉紅色斑點來定性或半定量[17]。Verheijen R等人[18]制得了磺胺二甲嘧啶膠體金檢測試紙條測定稀釋后的新鮮牛奶，檢測限20 ng/mL，10 min內(nèi)完成檢測。GICA法簡便靈敏，結(jié)果準確且易判定，可用于現(xiàn)場的SAs多殘留的快速監(jiān)測分析。

3.2.4 生物傳感器免疫分析法

生物傳感器免疫分析法（BIA）是免疫測試與生物傳感技術(shù)的融合，將抗原（抗體）固定在膜或肌體傳感器的表面，與相應(yīng)的抗體(抗原)生成穩(wěn)定的親和產(chǎn)物后，導致膜或電極兩側(cè)電位改變，產(chǎn)生可檢測的電信號。BIA具有很高的選擇性與靈敏度，且可實現(xiàn)自動化，適于現(xiàn)場檢測。Gaudin V等人[19]采用BIA測定牛奶中SM2殘留，檢測限為0.17 μg/kg，流速2 nL/min。1990年，Biacore AB公司開發(fā)出首臺商品化SPR儀器，隨著一系列SAs族特異性抗體的制備，為SAs多殘留檢測提供了新的途徑，已經(jīng)成功用于牛奶，豬肉等動物食品的SAs檢測。

3.3 理化分析法

理化分析法常作為動物食品中SAs殘留檢測的確證方法，其中HPLC方法應(yīng)用最為廣泛，我國農(nóng)業(yè)部采用HPLC/MS法[20]。其次是氣相色譜法（GC）和薄層色譜（TLC），毛細管電泳（CE） 用的較少。儀器分析方法準確、靈敏度高，可同時測定多種藥物，但是此類方法通常需要大量的資金投入，樣品前處理繁瑣費時，不適合現(xiàn)場大量樣本的快速篩選檢測。

3.3.1 高效液相色譜法

HPLC是采用極性固定相及弱極性流動相共同組成的色譜體系，是SAs殘留檢測的國際公認的分析方法，但在多種SAs殘留檢測時，有2～3種未分離的藥物只能通過更換流動相才可以完全分離。陳振桂等人[21]采用HPLC測定鰻魚、鮰魚、龍蝦中13種SAs殘留，回收率為62%～97%，最低檢測限0.02 mg/kg。有學者采用反相色譜法（RP-HPLC） 檢測SAs殘留，高智席等人[22]采用Sep-Pak C18柱凈化，RP-HPLC測定肉牛組織中SM2含量，最低檢測限為4.8μg/kg。相比于GC，HPLC分離能力強、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點。近年來，隨著高效色譜柱、檢測柱衍生化及計算機聯(lián)用等技術(shù)的使用，HPLC的檢測效率得到提高。超高效液相色譜（UPLC）就是在HPLC的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分析技術(shù)，固定相粒徑僅1.7 μm，因此具有較高的線速度、流速和反壓，樣品分離也更高效省時，峰容量更大，比HPLC分離效果更好。羅成江等人[23]按照農(nóng)牧發(fā)[2001]38號動物性食品中SAs殘留的分析方法，采用UPLC代替原HPLC測定豬肉中SAs殘留，試驗顯示UPLC法在節(jié)省分析時間和溶劑用量上更有優(yōu)勢，采用UPLC提高檢測精確度是未來發(fā)展的趨勢。

3.3.2 氣相色譜法

在早期的SAs殘留分析中GC應(yīng)用較多，1993年國標就采用GC測定食品中SAs殘留。與HPLC相比，GC操作簡單、檢測器靈敏度高及檢測限低，對樣品凈化要求較高，因此樣品處理相對復雜，需要專業(yè)的操作人員分析，不適合一般實驗室采用。在采用HPLC檢測動物性食品中SAs殘留后，GC逐漸被淘汰[24]。

3.3.3 薄層色譜法

薄層色譜法是利用不同組分對相同吸附劑吸附效果的不同，從而對樣品進行分離、鑒定和定量的技術(shù)，具有特殊的選擇性、無毒價廉、操作方便等優(yōu)點。與GC和HPLC相比，TLC的自動化性、分辨率和重復性相對較低，但仍是一種有效的分離分析技術(shù)，經(jīng)常作為樣品的篩選方法。劉雪紅等人[25]采用TLC測定雞肉中SAs殘留，試驗顯示分離良好，回收率為60%左右，檢出限0.05 μg/mL。美國農(nóng)業(yè)部食品安全局也曾采用TLC篩選SAs殘留，Gerry J等人[26]用TLC檢測沙丁魚中SAs殘留，檢測限可達0.13 mg/g。

3.3.4 毛細管電泳法

毛細管電泳（CE）是根據(jù)各組分在高壓電場的前提下，在毛細管中因遷移速度不同而實現(xiàn)分離，而且SAs有一定的水溶性、帶電荷及紫外吸收等特點適用于CE分析。CE進樣量小，柱效比HPLC還高，對樣品的凈化要求不高。與GC和HPLC相比，CE分離快速高效，且微量低耗。同時，CE進樣量少，使其紫外檢測的靈敏度受限，無法檢測到低濃度的SAs殘留，現(xiàn)在已較少使用。Lamba S等人[27]采用膠束電泳法檢測牛奶中5種SAs殘留，7 min內(nèi)分離SAs，檢測限為1.59～7.68 nmol/L，回收率為85%～114%。

3.3.5 聯(lián)用技術(shù)

聯(lián)用技術(shù)是將色譜的快速分離技術(shù)與質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)相結(jié)合，既簡化了樣品的前處理，又實現(xiàn)了對目標化合物更準確的分析，目前主要采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS） 和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）測定動物性食品中磺胺類藥物殘留。GC-MS法是SAs殘留分析常用的確證方法，并且靈敏度高，但是樣品前處理需要衍生化，除去分子中的極性基團。Anderw Cannavan等人[28]采用SCX柱凈化，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測豬肉中的SMZ殘留，檢測限為0.001 μg/g。HPLC-MS特異性強及檢出限低，且不用對樣品進行衍生化，但是設(shè)備的采購及運行費用較高，暫時無法作為常規(guī)分析方法。Fuh Ming-Rens S等人[29]采用HPLC-MS測定動物組織中的SAs殘留，檢測限為0.01 μg/g。

理化分析方法中HPLC和GC的靈敏度高及特異性好，但是樣品前處理復雜，回收率有時偏低，且需要使用大量有毒溶劑分離。HPLC-MS具有很好的準確性，但分析方法相對復雜、成本高，不利于普及。微生物學檢測法應(yīng)用較廣泛，但特異性好的菌株很難篩選到，且與結(jié)構(gòu)類似物有交叉反應(yīng)，不適合同時檢測多種SAs殘留。TLC簡單準確，但是靈敏度低及重復性差。CE微量低耗，靈敏性受限。

4 展望

綜上所述，只有研制出靈敏高效的便攜檢測方法，同時實現(xiàn)對多殘留同步確證的分析方法，才能有效地對動物源性食品中SAs殘留進行監(jiān)控，從法律角度加強對違法行為的打擊，提高動物性食品的安全。

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Process for Analysis of Sulphoamide Residues in Animal Products

WU Suolian1，KANG Huaibin2，LI Dongjiao1，ZHANG Yunxia1，ZHU Dirong1
（1.School of Medical，Ezhou Polytechnic，Ezhou，Hubei 436000，China；2.School of Food Engineering and Biotechnology，He'nan University of Science and Technology，Luoyang，He'an 471000，China）

Sulfonamides are widely used in clinical veterinary medicine and animal husbandry for its broad-antimicrobial spectrum and low price.There is a risk of SAs residues remaining in animal products if these drugs have been administered improperly，abuse of SAs has generated potentially serious problems in human health and affected food safety.Therefore，it is necessary to study the residues of sulfonamides in animal products.The paper focused on the sample preparation and instrument testing methods of detection of the metabolites sulfa，including summarizing the characteristics of each detection method，scope.The article can be considered as a basis for the research on the most emcient determination methods.

animal products；residue of sulphonamides；sample preparation；analysis method

S859.84

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.046

1671-9646（2017） 10b-0058-04

2017-08-23

鄂州職業(yè)大學校級課題（2016YBA51）；湖北省教育廳科學技術(shù)研究項目（B2017531）。

吳鎖連（1977— ），女，碩士，講師，研究方向為食品加工。