楊昊，公丕學(xué)，王駿，劉艷明，薛霞，盧蘭香，祝建華

植物性食品農(nóng)藥殘留檢測中高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法的應(yīng)用

楊昊，公丕學(xué)，王駿，劉艷明，薛霞，盧蘭香，祝建華

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250000）

目前，食品安全中最大瓶頸是復(fù)雜基質(zhì)中痕量成分的多殘留組分的檢測分析，為解決這一難題，提出了一種分離能力強(qiáng)、靈敏性高及檢測效率快的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC—MS/MS），并聯(lián)合復(fù)合分子印跡固相萃取技術(shù)對(duì)樣品前處理過程的提取及凈化步驟進(jìn)行優(yōu)化，選用不同種類的果蔬、谷物作為樣本基質(zhì)，對(duì)10種三嗪類及磺酰脲類農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明目標(biāo)化合物的回收效率在63.2%~118.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為 1.82~14.5%，該方法操作便捷、成本小且可靠性高，能夠滿足植物性食品農(nóng)藥殘留的日常檢測。

植物性食品；高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法；除草劑；農(nóng)藥殘留

植物性食品是能夠?yàn)槿祟愄峁┠芰炕驙I養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，其安全問題關(guān)系著每一個(gè)人的生命健康，但因?yàn)檗r(nóng)藥的違規(guī)違法或是超規(guī)格使用，加之檢測體系的不健全，很容易造成不同程度的農(nóng)藥殘留問題，進(jìn)而埋下安全隱患。而且，現(xiàn)代農(nóng)藥種類繁多，化合物組成復(fù)雜，傳統(tǒng)的氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、氣相—色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）等檢測方法，檢測的精準(zhǔn)性和全面性有限、覆蓋的農(nóng)藥數(shù)量較少，且操作過程繁瑣、有機(jī)溶劑使用量較大，成本較高[1]，迫切需要引入一種高效、便捷且檢測限低農(nóng)藥多殘留檢測技術(shù)，針對(duì)此，本文建立了一種高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法，其首先利用色譜將復(fù)雜混合物分離為單一的組分，而后使用質(zhì)譜檢測技術(shù)獲取化合物分子離子及碎片信息，并聯(lián)用復(fù)合分子印跡固相萃取技術(shù)對(duì)樣品前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，完成了不同植物性食品的10種三嗪類及磺酰脲類農(nóng)藥殘留的監(jiān)測分析，檢測效率及精準(zhǔn)度均有顯著性提升，該方法分離能力強(qiáng)、靈敏度高且選擇性好，可以對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的痕量物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，將在未來農(nóng)藥殘留檢測分析中發(fā)揮重要的作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

乙腈、甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)；甲酸、乙酸（色譜純，阿拉?。徽和椋ㄉV純，美國MREDA公司）；10 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度在96%-98%之間，美國Sigma-Aldrich公司），實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)過Milli-Q超純水系統(tǒng)（Merck Millipore，法國）過濾提純后的高純水，復(fù)合分子印跡固相萃取柱（MixedC8/SiSCX固相萃取柱，美國Agilent公司）[2]。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，從選取的10種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品中準(zhǔn)確稱取相應(yīng)的分量，將其置于10 mL容量瓶之中，并在其中放入定量甲醇溶液作為稀釋劑，以滴管方式將其加入容量瓶以便進(jìn)行精準(zhǔn)配制，最終制成的單一標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為 500 μg/mL，在-20 ℃溫度予以保存；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，從上述農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取1 mL的溶液，放入50 mL溶液瓶中，以乙腈將其稀釋定容成為質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的混合工作液，于4 ℃下避光保存。

1.2 儀器與實(shí)驗(yàn)裝置

選用Agilent1290/6460超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），配備PV-550納噴霧離子源(美國New Objective公司)以及Analyst1.6.1色譜工作站，電噴霧離子化源(ESI)(美國ABI公司)、氮吹儀（GIPP-AUTO-12S，上海繼譜電子科技有限公司），Syncore Analyst平行定量濃縮儀（瑞士BUCHI公司），V-710真空泵（瑞士BUCHI公司）、B-740再循環(huán)冷卻系統(tǒng)，XPN-100/90/80超速離心機(jī)（美國Beckman公司）。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜：Agilent ZORBAX Rx-C8 HPLC液相色譜柱（粒徑5 μm,4.6 mm×250 mm）流動(dòng)相A為0.1%的甲酸水溶液[3]，流動(dòng)相B為乙腈，流速：0.2，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：3 μL,采用梯度洗脫程序：0~5 min,A∶B=10∶90;5~10 min,A∶B=10∶90;10~12 min,A∶B=40∶60;12~13 min,A∶B=70∶30;流速：0.2 mL/min。

質(zhì)譜：UPLC系統(tǒng)配有三級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜，離子源為電噴霧電離（ESI），溫度設(shè)定為450℃，多反映監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行分析，正離子掃描，離子源霧化器壓力Gas1、輔助加熱氣壓Gas2、氣簾氣（CUR）均設(shè)定為30 Psi，噴霧電壓（IS）:5 500 V[4]，而具體的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 10種農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測條件（碎片離子中標(biāo)*為定量離子）

1.4 樣品前處理

提?。簻?zhǔn)確稱取2 g樣品放入50 mL離心管中，將15 mL乙腈添至其中，漩渦混勻2 min,于震蕩器上劇烈震蕩30 min, 在5 000 r/min條件下離心5 min，移取兩次上層清液予以合并（所選樣品中花生、玉米具備高油脂性，可將用乙腈飽和的20 mL正己烷溶液添入其中，并予以高速震蕩混合，將己烷層剔除，在50 ℃下將所提取的清液置于定量濃縮儀中濃縮至干，然后再以2 mL乙腈進(jìn)行再溶解，從中吸取1 mL以以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

凈化：用3 mL乙腈活化MixedC8/SiSCX固相萃取柱，且柱子中的乙腈不能完全流干，在固相萃取柱中加入1 mL上樣液，過柱速度為每分鐘0.3 mL，全部用完為止。首要步驟用1 mL水對(duì)柱子進(jìn)行淋洗，待水流凈，再用6 mL酸醇溶液（以1∶9的乙酸與甲醇配制而成）及2 mL甲醇溶液對(duì)柱子進(jìn)行淋洗，在50 ℃下用氮?dú)獯蹈蓛x將獲得洗脫液吹干，以1 mL乙腈進(jìn)行再溶解，并通過流動(dòng)相0.1%甲酸加水稀釋后待測定。

再生：用乙酸與甲醇以1∶9配置成為4 mL酸醇溶液對(duì)MixedC8/SiSCX柱淋洗3次以上，直至沒有目標(biāo)物洗脫，可多次重復(fù)使用小柱。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選取

結(jié)合以往的研究經(jīng)驗(yàn)，在不同基質(zhì)中添加濃度為10 μg/kg的甲醇、乙酸、乙腈、丙酮等溶液，可知，這4種溶劑的提取效率依次為：80%~115%、45%~80%、46%~89%、59%~110%，其中，色素含量較高的為丙酮、甲醇提取液，而溶液凈度及提取效率較高的為乙酸乙酯，，尤其是乙腈對(duì)農(nóng)藥的溶解度較大，且分子小，滲透力強(qiáng)，固以乙腈作為提取液，在其中添加硫酸鎂來去除水分，使得農(nóng)藥更好的溶于乙腈，便于后續(xù)凈化。

2.2 凈化方法的確定

植物性食品中大豆、玉米是高油脂的樣品，其會(huì)影響提取液的澄清度，為此，須用正己烷對(duì)提取的溶液進(jìn)行液萃取，以將多余的油脂類干擾物剔除，然后再過柱完成凈化[5]，而正己烷可在乙腈中溶解，通過獲得乙腈飽和正己烷來凈化，可顯著提升回收率，以滿足后續(xù)檢測需求。

2.3 固相萃取過程優(yōu)化

比較甲醇、乙腈、酸醇［乙酸：甲醇（V/V）=1∶9］、水等 4 種提取溶液的吸附性能，結(jié)果表明，提取溶液選用水和乙腈時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多數(shù)農(nóng)藥組分的吸附，但乙腈會(huì)造成噻吩磺隆、單嘧磺隆部分損失[6,7]，因此，只以水為淋洗劑，而且，與乙腈相比，甲醇的氫鍵作用常數(shù)較大，印跡聚合物在其中的吸附性能最低，以甲醇為洗脫溶劑為最佳選擇，且為降低氫鍵作用力，可適當(dāng)添加乙酸，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的全部洗脫。同時(shí)，通過甲醇、酸醇及兩者融合的洗脫能力的對(duì)比，使用2 mL甲醇、6 mL酸醇可實(shí)現(xiàn)洗脫完全，并確?；厥章省?/p>

2.4 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

色譜分離時(shí)，流動(dòng)相、進(jìn)樣介質(zhì)及體系均會(huì)造成色譜峰形， 使用乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，化合物的色譜峰性變寬、靈敏度降低，呈弱酸性的磺酰脲類農(nóng)藥，以甲酸或醋酸酸化，并將0.1%甲酸加入水中可改變化合物的峰形，加快化合物的例子化，為此，最終選擇乙腈-0.1%甲酸為最佳流動(dòng)相，10種農(nóng)藥的分離檢測將在13 min內(nèi)完成，結(jié)果顯示在既定時(shí)間內(nèi)所有目標(biāo)化合物均出峰，且峰形尖銳，分析效率較高，分離度較好。

2.5 方法學(xué)考察

線性范圍與定量限：完成上述優(yōu)化步驟后，可據(jù)此配置相關(guān)的混合工作液以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，軸橫向坐標(biāo)設(shè)定為質(zhì)量濃度，軸縱向坐標(biāo)設(shè)定為峰面積，由此完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制并進(jìn)行線性回歸[8]，所得結(jié)果表明10種農(nóng)藥在濃度范圍為0.5~40 ng/mL時(shí)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)取值范圍為0.997 1~0.999 9，具備實(shí)驗(yàn)的可行性；同時(shí)，以S/N≥10確定方法的定量限為0.38~2.04 μg/kg[9]，具體結(jié)果如表2所示。

方法的準(zhǔn)確度與精密度：選取空白樣品基質(zhì)，將配制的質(zhì)量濃度為5、10、20 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入其中， 依照確定的提取、凈化方法在選定的UPLC-MS/MS 條件下進(jìn)行測定，每個(gè)濃度水平重復(fù)測定6次，計(jì)算所得平均回收率為63.2%~118.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD為1.82~14.5%，滿足了復(fù)雜基質(zhì)中多組分痕量殘留檢測需求。

表2 10種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)、定量限與回收率

表3 10種樣品的HPLC-MS/MS檢測結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品測定

隨機(jī)購買10種不同的果蔬、谷物作為研究樣品，根據(jù)上述方法對(duì)其進(jìn)行HPLC-MS/MS測定，結(jié)果如表3所示，小麥、玉米、大豆、甘蔗、菠蘿、花生等6種植物性食品中均含有不同種類的農(nóng)藥殘留，根據(jù)GB2763-2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的相關(guān)規(guī)定，噻吩磺隆在小麥、玉米、大豆及花生中的最大殘余限量為0.05 mg/kg，而實(shí)測結(jié)果顯示其在這四類植物性作物中的殘余量分別為4.259 1、2.316 8、1.271 3、3.125 4 mg/kg、均明顯超出最大殘余限量；莠滅凈在菠蘿中的最大殘余限量為0.2 mg/kg，在甘蔗中的最大殘余限量為0.05 mg/kg，但檢測結(jié)果該種農(nóng)藥成分在這兩類作物中的殘余量各為1.235 6、0.271 4 mg/kg，也存在超標(biāo)現(xiàn)象，同時(shí)，西瑪津在菠蘿中的最大殘余限量為0.1 mg/kg，在甘蔗中的最大殘余限量為0. 5 mg/kg，實(shí)驗(yàn)檢測的殘余量也嚴(yán)重超標(biāo)，這說明菠蘿、甘蔗兩類作物在未來種植過程中應(yīng)該控制相應(yīng)農(nóng)藥的使用量；而氰草津在玉米中、單嘧磺隆在小麥中的最大殘余量分別為0.05、0.1mg/kg，實(shí)測結(jié)果也存在過限的問題。

3 結(jié)束語

通過高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法并結(jié)合復(fù)合分子印跡固相萃取技術(shù)建立的植物性食品農(nóng)藥殘留檢測方法，依據(jù)樣品種類給予不同的凈化方法，有效提升了凈化效果，突破了基質(zhì)干擾問題，且操作更為簡單、靈敏度高、選擇性強(qiáng)，對(duì)農(nóng)藥殘留的分離效果更好，根據(jù)研究結(jié)果顯示，在0.5~40 ng/mL濃度范圍內(nèi)10種農(nóng)藥線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)最小值為0.997 1，而且，分別在5、10、20 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)液下對(duì)樣品進(jìn)行了重復(fù)測定，10種目標(biāo)化合物的回收率范圍為63.2%~118.5%，RSD為1.82~14.5%，定限量為0.38~2.04 μg/kg，滿足了復(fù)雜基質(zhì)多組分殘留的高效、準(zhǔn)確檢測，對(duì)于未來農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的優(yōu)化發(fā)展有一定的參考價(jià)值。

［1］譚陽陽,牛墨,田紅. QuEChERS——超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法在動(dòng)物源食品中禁限用獸藥殘留檢測中的應(yīng)用[J]. 食品安全導(dǎo)刊,2017(09):112-113.

［2］高志斌. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定各類食品中丙烯酰胺的實(shí)際應(yīng)用[J]. 科技展望,2016,26(33):94-95.

［3］馬帥,王蒙,韓平,王紀(jì)華,馮曉元. QuEChERS-超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法在食品真菌毒素檢測中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào),2016,7(08):3020-3024.

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［5］彭西甜,胡西洲,沈菁,龔艷,彭立軍,馮鈺锜. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在食品中農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(04):572-577.

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Application of High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Determination of Pesticide Residues in Vegetable Foods

，，，，，，

（Shandong Institute of Food and Drug Inspection, Shandong Jinan 250000，China）

The biggest bottleneck in food safety was the detection of multi residue components of trace components in complex matrix, in order to solve this problem, a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC - MS/MS) with high separation efficiency, strong sensitivity and fast detection was proposed, and molecular imprinting solid phase extraction technique was used to optimize the sample pretreatment and purification steps. Different kinds of fruits and vegetables were chosen as the samples, 10 kinds of triazine and sulfonylurea pesticide residues were detected. The results showed that the recovery efficiency of the target compounds was in the range of 63.2%~118.5%, the relative standard deviation was 1.82%~14.5%.This method is easy to operate, and has low cost and high reliability, so it can satisfy the daily detection of pesticide residues in vegetable foods.

Vegetable foods; HPLC - MS/MS; Herbicide; Pesticide residues

TQ457

A

1671-0460（2017）12-2532-03

2017-08-28

楊昊（1986-），男，山東省樂陵市人，工程師，研究方向：食品中農(nóng)藥獸藥殘留在液相色譜質(zhì)譜中檢測方法研究。