劉冬梅 周全興 周勁松

(華南理工大學 食品科學與工程學院， 廣東 廣州 510640)

乳酸，學名為α-羥基丙酸，分子式為CH3CH(OH)COOH，相對分子質(zhì)量為90.08.由于分子中含有一個不對稱碳原子，故具有旋光性.乳酸是一種用途廣泛的有機酸，乳酸、乳酸鹽及其衍生物都能廣泛地應用于醫(yī)藥、化工等諸多領域.但是，由于人體只能代謝L-乳酸，而缺少代謝D-乳酸的相關酶類，所以食品中不適合加入D-乳酸.考慮到其廣泛的用途，比如，在食品工業(yè)中，可用作酸味劑、保鮮劑和抑菌劑；在醫(yī)療行業(yè)，具有極好的生物降解性和生物相容性的聚乳酸可用于手術(shù)縫合線、藥物載體等生物醫(yī)藥材料上[1]；在化工行業(yè)，乳酸及其鈉鹽可作為護膚品的保濕劑、滋潤劑[2]，如果能找到適合的生產(chǎn)方式，降低乳酸、特別是高光學純度L-乳酸的生產(chǎn)成本，就能擴大乳酸的應用范圍.

當前，乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、酶法、生物發(fā)酵3種.微生物發(fā)酵法是以各種糖類、淀粉類物質(zhì)為原料接種微生物，發(fā)酵生產(chǎn)得到乳酸，由于工藝相對簡單、成本低廉、有毒副產(chǎn)物較少，是當前生產(chǎn)乳酸的主要方法.從目前的文獻報道看，使用的菌株主要分為根霉、細菌兩大類，如黑曲霉、乳酸菌等，亦有使用鏈球菌 (Streptococcus)、明串珠菌 (Leuconostoc)和腸球菌屬(Enterococcus)[3]，但是當前使用的菌株均有其顯著缺點，如根霉類菌株多屬于好氧發(fā)酵，對電、汽要求較高，且產(chǎn)物中雜酸較多，糖酸轉(zhuǎn)化率不高.乳酸菌作為細菌類的代表，是當前乳酸生產(chǎn)的主力，具有發(fā)酵周期短，代謝產(chǎn)物單一等優(yōu)點.但是其發(fā)酵溫度較低、容易染菌；產(chǎn)物中含有一定量的D-乳酸，導致產(chǎn)物的光學純度不高；乳酸菌在合成維生素B和一些氨基酸方面存在缺陷，需要在發(fā)酵過程中補充復雜的營養(yǎng)成分[4]，這些因素均不利于降低生產(chǎn)成本.

本研究使用的芽孢桿菌BCS 13002具有對營養(yǎng)底物的需求低、本身培養(yǎng)溫度高而不易被污染、生產(chǎn)出來的L-乳酸光學純度高等優(yōu)點，而且有報道凝結(jié)芽孢桿菌能直接利用玉米淀粉發(fā)酵，因此具有極大的研究價值與應用潛力.凝結(jié)芽孢桿菌本身具有乳酸菌、雙歧桿菌的保健功效，已經(jīng)政府批準用于治療腸道疾病，證明了該菌株本身及其產(chǎn)物的安全性，又具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性，十分適合轉(zhuǎn)化為工業(yè)生產(chǎn).文中首先比較碳源、中和劑對菌株生長、發(fā)酵的影響，經(jīng)響應面優(yōu)化了葡萄糖、MgCl2·6H2O和MnSO4·H2O的添加量后，在5 L發(fā)酵罐中，分別以葡萄糖和玉米淀粉為碳源，開放式發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，以期找到一個安全、簡潔、高效的生產(chǎn)L-乳酸的方式，為后續(xù)生產(chǎn)、研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

芽孢桿菌(Bacillussp.)BCS 13002 (CGMCC NO.7431)，由華南理工大學食品質(zhì)量與安全實驗室從發(fā)酵泡菜中分離篩選得到，并于2013年4月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心.

1.1.2 材料和試劑

MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、NaOH，分析純，天津市福晨化學試劑廠出品；3，5-二硝基水楊酸，化學純，上?？曝S化學試劑有限公司出品；98%L-乳酸、93%D-乳酸，色譜純，上海Sigma-Aldrich公司出品；硫酸，分析純，廣州化學試劑廠出品；丙三醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司出品；耐高溫α-淀粉酶(酶活力≥70 000 U/mL)、葡萄糖淀粉酶(酶活力≥130 000 U/mL)，廣州裕立寶生物科技有限公司出品；無水葡萄糖、蛋白胨、酵母粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司出品；溶菌酶，生化試劑，北京天恩澤生物公司出品；DNA提取試劑盒、TBE電泳緩沖液、DNA Marker (D-2000)，Takara公司出品；超純水，實驗室自制.

1.1.3 試劑溶液及培養(yǎng)基的配制

(1)種子培養(yǎng)基：無水葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母粉25 g，溶解于1 L超純水中，混合均勻后于121 ℃滅菌，20 min后冷卻備用；

(2)基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基中多加入36 g的無水葡萄糖，混合均勻后于121 ℃滅菌，20 min后冷卻備用；

(3)0.005 mol/L的H2SO4溶液：濃硫酸0.27 mL，用超純水定容至1 000 mL.

1.2 儀器與設備

JJ200Y電子天平(美國雙杰兄弟(集團)有限公司出品)，YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠出品)，5804R低溫高速冷凍離心機(艾本德中國有線公司出品)，PHS-3C pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司出品)，752S紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司出品)，XSP-2CA生物顯微鏡(上海光學儀器廠出品)，Biostat Aplus 5 L自動發(fā)酵罐系統(tǒng)(德國布朗公司出品)，高效液相色譜儀系統(tǒng)含600泵多通道輸送系統(tǒng)、717自動進樣器、2996 PDA 二極管陣列檢測器(沃特世科技上海有限公司出品)；色譜柱為手性柱 Chirex 3126 (D)-penicillami，4.6 mm ID×250 mm L，5 μm；有機酸柱Rezex ROA-Organic Acid H+，300 mm7.8 mm(美國菲羅門公司出品).

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分子生物學和生理生化鑒定

根據(jù)參考文獻[5]進行菌株的DNA提取，取過夜培養(yǎng)的菌液1.0 mL，于12000 r/min室溫離心1 min，棄上清液，沉淀重懸于0.6 mL的溶菌酶溶液中，顛倒混勻5～10次后置于37 ℃保溫40 min，利用試劑盒提取菌種基因組DNA；利用其模板DNA進行PCR擴增，擴增體系如表1所示，PCR擴增條件為：94 ℃、預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min.電泳檢測回收并將擴增得到的片段進行DNA測序，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列BLAST比對，進行16S rDNA鑒定.分離株的形態(tài)生理生化檢測分析可參照伯杰氏細菌鑒定手冊(第9版)[6]進行.

1.3.2 HPLC測定發(fā)酵液中L-乳酸及葡萄糖含量

①L-乳酸的測定：發(fā)酵液樣品經(jīng)8 000 r/min離心，取上清液適當稀釋后，過0.22 μm濾膜過濾后備用；流動相為2 mmol/L CuSO4溶液(溶劑為5%的異丙醇溶液)，使用前經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣；流速為1.2 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測器為二極管陣列，檢測波長為254 nm；標準品和樣品溶液用前均經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾并超聲脫氣；進樣量為5 μL；用Empower積分軟件積分.②葡萄糖含量測定：樣品處理與①相同，流動相為0.005 mol/L的H2SO4溶液，流速為0.6 mL/min；柱溫為40 ℃；示差檢測器檢測；進樣量為10 μL.

1.3.3 淀粉酶活力測定

參照GBT 24401—2009 α-淀粉酶制劑進行.

1.3.4 碳源對BCS 13002發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響

以發(fā)酵基礎培養(yǎng)液為基礎，設定總碳源含量為20 g/L，把葡萄糖和木糖按5∶0、3.75∶1.25、2.5∶2.5、1.25∶3.75、0∶5 的比例組合，添加到培養(yǎng)基中，另把葡萄糖和玉米淀粉按5∶0、2.5∶2.5、0∶5的比例組合，添加到另一組培養(yǎng)基中，以8 mol/L的NaOH為中和劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至6.5左右，在45 ℃、120 r/min下震蕩培養(yǎng)48 h，取樣測定L-乳酸和乙酸的含量，比較碳源對L-乳酸生產(chǎn)的影響.

1.3.5 中和劑對BCS 13002發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響

以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基按1.3.4的方式震蕩培養(yǎng)，中和劑分別使用Ca(OH)2粉末、CaCO3粉末和8 mol/L的NaOH，每隔6～8 h調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使之保持在6.5附近，48 h后取樣測定L-乳酸和乙酸的含量，比較不同中和劑對L-乳酸生產(chǎn)的影響.其中，針對CaCO3粉末會與乳酸生成乳酸鈣沉淀，需特別加入4 mol/L H2SO4溶液調(diào)pH值至2附近，記錄使用的H2SO4溶液的體積，用以折算L-乳酸和乙酸的含量.

1.3.6 BCS 13002在5 L發(fā)酵罐中的分批補料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸

根據(jù)前期的研究，把充分活化的菌種活化液按5%的體積比接入裝有1 L基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L全自動發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為45 ℃、120 r/min，以 8 mol/L的NaOH為中和劑，控制pH在6.5.發(fā)酵期間，每6～8 h取樣，按照1.3.2測定發(fā)酵液中葡萄糖含量及L-乳酸含量，當葡萄糖含量小于10 g/L時，補充46 g無水葡萄糖粉末，共補充5次，至葡萄糖不再消耗即為發(fā)酵終點.

1.3.7 以玉米淀粉為原料分批補料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸

配制20%玉米淀粉溶液，加入10 μL耐高溫α-淀粉酶(酶活力≥70 000 U/mL)，70 ℃攪拌水浴20 min，制成玉米淀粉水解液，然后與32 μL耐高溫葡萄糖淀粉酶(酶活力≥130 000 U/mL)、5%芽孢桿菌BCS13002種子活化液一同接入裝有2 L基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L全自動發(fā)酵罐中進行同步糖化發(fā)酵，期間以8 mol/L NaOH作為中和劑，培養(yǎng)條件如1.3.6.發(fā)酵期間，每隔6～12 h取樣測定葡萄糖含量和L-乳酸含量，當葡萄糖不再產(chǎn)生且L-乳酸含量不再增加時，補充250 g的20%玉米淀粉水解液，共補充6次，至葡萄糖不再消耗即為發(fā)酵終點.

1.3.8 糖酸轉(zhuǎn)化率的計算

發(fā)酵結(jié)束后，分別按照實驗方法(2)和(3)測定L-乳酸含量和葡萄糖含量，并根據(jù)發(fā)酵終點發(fā)酵液的體積計算L-乳酸和葡萄糖質(zhì)量，再根據(jù)以下公式計算糖酸轉(zhuǎn)化率，糖酸轉(zhuǎn)化率即為：生產(chǎn)L-乳酸質(zhì)量/(葡萄糖總質(zhì)量-殘余葡萄糖質(zhì)量)100%.當使用玉米淀粉進行同步糖化發(fā)酵時，總的葡萄糖質(zhì)量按玉米淀粉徹底水解所產(chǎn)生的葡萄糖的量計算，理論上每100 g的玉米淀粉水解后可得到110 g的葡萄糖，文中實際測得為105 g.

2 結(jié)果與討論

2.1 BCS 13002的鑒定

BCS13002在平板上的單菌落呈圓形凸起且富有光澤，邊緣整齊無皺褶，表面光滑，菌落呈乳白色，稍透明.菌種經(jīng)結(jié)晶紫單染后，再經(jīng)過16×100倍放大，在光學顯微鏡下觀察，菌體為桿狀.生理特征：接觸酶陰性，氧化酶陰性，不液化明膠，不還原硝酸鹽，精氨酸水解陰性，酪素水解陰性，V-P試驗陽性，革蘭氏染色為陽性菌，兼性厭氧菌，可利用阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、蔗糖，不能利用鼠李糖、棉籽糖.產(chǎn)酸不產(chǎn)生氣，能水解淀粉，在15～60 ℃的溫度下生長.提取其DNA，擴增其16S rDNA并測序，其與Bacilluscoagulans(凝結(jié)芽胞桿菌)的16S rDNA 序列有大于99%的同源性，見圖1核苷酸序列，并構(gòu)建進化樹見圖2.根據(jù)形態(tài)、生理生化特性和DNA保守序列等3方面的信息，確定其為凝結(jié)芽孢桿菌.

圖1 BCS 13002菌株的16S rDNA序列

圖2 BCS 13002的進化樹

2.2 培養(yǎng)基中3種碳源對BCS 13002發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響

如圖3所示，使用葡萄糖作為唯一碳源時，產(chǎn)物以L-乳酸為主，發(fā)酵48 h后，L-乳酸為16.05 g/L，乙酸為4.71 g/L，L-乳酸與乙酸的比例約為3.41，隨著碳源的補充，L-乳酸繼續(xù)積累，L-乳酸的比例持續(xù)增大.當碳源中葡萄糖的比例降低(按質(zhì)量比計)，木糖比例升高時，L-乳酸的比例持續(xù)下降.以木糖作為唯一碳源時，生產(chǎn)的L-乳酸為11.51 g/L，乙酸為 9.82 g/L，L-乳酸與乙酸的比例為1.17，隨著碳源的補充，乙酸將持續(xù)大量的積累而L-乳酸基本不再產(chǎn)生.說明BCS 13002適合以葡萄糖為碳源生產(chǎn)L-乳酸.

圖3 葡萄糖與木糖的不同質(zhì)量比對產(chǎn)酸的影響

Qin等[7]使用的菌株以葡萄糖為碳源，Ye等[8]使用的菌株以木糖為碳源，Kenneth等[9]使用的菌株是以葡萄糖、木糖、樹膠醛糖為復配碳源，他們的乳酸產(chǎn)率均超過85%，均屬于同型發(fā)酵.一般認為葡萄糖通過EMP途徑進行同型發(fā)酵，木糖通過磷酸戊糖途徑(PP)進行同型發(fā)酵[10]，但對于混合糖源的代謝通路，仍有待研究.而本研究中的BCS 13002利用葡萄糖作碳源生產(chǎn)L-乳酸時，糖酸轉(zhuǎn)化率約為82.31%，說明葡萄糖應是通過EMP途徑進行代謝[11].

同時，本研究還比較了玉米淀粉和葡萄糖作碳源時，菌株的產(chǎn)酸效果，為下一步同步糖化提供參考.如圖4所示，碳源以葡萄糖為主時，產(chǎn)物仍以L-乳酸為主.逐漸提高碳源中玉米淀粉的比例(按質(zhì)量比計)，會導致產(chǎn)物中L-乳酸大量減少，乙酸大量增多，碳源完全由玉米淀粉構(gòu)成時，發(fā)酵產(chǎn)物中基本不含有L-乳酸，乙酸含量高達14.05 g/L.另外，研究中還發(fā)現(xiàn)，玉米淀粉能促使BCS 13002分泌胞外淀粉酶，其酶活最高達3 873 U/mL，當碳源完全由葡萄糖組成時，無法測出淀粉酶酶活，說明玉米淀粉是刺激菌株分泌胞外淀粉酶的主要誘因.

圖4 葡萄糖與淀粉的不同質(zhì)量比對產(chǎn)酸的影響

目前，有關凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)乳酸的報道，主要有3種方式，一是直接使用戊糖、己糖作為碳源；二是使用木質(zhì)素、各類淀粉，以液化酶、糖化酶處理，或者經(jīng)酸堿、高溫、高壓處理后，作為碳源加入；三是多種細菌協(xié)同作用，分解大分子多糖原料[11].Ohkouchi等[12]利用乳酸桿菌發(fā)酵淀粉和食物殘渣生產(chǎn)L-乳酸，并研究了pH和錳離子對乳酸產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)當Mn2+的含量從0分別提高到20、200 μmol/L時，乳酸的產(chǎn)率從0.082 g/(L·h)分別提高到0.187和0.206 g/(L·h).Narita等[13]用牛鏈球菌轉(zhuǎn)化粗淀粉為L-乳酸，轉(zhuǎn)化率為88%，乳酸光學純度為95.6%，這些都可以為后續(xù)研究所借鑒.

2.3 3種中和劑對BCS 13002發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響規(guī)律

圖5所示，使用NaOH作為中和劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值時，乳酸產(chǎn)量明顯高于另外兩種中和劑，最終產(chǎn)量可達67 g/L.使用Ca(OH)2作為中和劑，L-乳酸產(chǎn)量為56 g/L，而使用CaCO3時，得到L-乳酸最少，為43 g/L.Qin等[14]分析了Na+與Ca2+對菌株代謝的影響，發(fā)現(xiàn)Na+與Ca2+分別使菌株1213和712個基因的表達量產(chǎn)生明顯變化.Ca2+使糖酵解通路幾個關鍵酶的表達出現(xiàn)顯著上調(diào)，而Na+使L-乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶和6-磷酸果糖激酶的表達下調(diào)的同時使丙酮酸脫氫酶復合體的表達量顯著上調(diào).而BCS 13002顯然對Na+有更高的適應性，Na+有助于L-乳酸的積累.

圖5 使用3種中和劑的發(fā)酵液中乳酸含量的變化

Fig.5 Changes of lactic acid in culture by three neutralizing agents

2.4 BCS 13002在5 L發(fā)酵罐中的分批補料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的規(guī)律

經(jīng)響應面優(yōu)化分析，得到最優(yōu)的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在此基礎上進行分批補料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，結(jié)果如圖6所示.隨著葡萄糖的積累，菌株生產(chǎn)L-乳酸的速度明顯下降，從2.02 g/(L·h)下降至0.27 g/(L·h)，在54～78 h間基本停止生產(chǎn)L-乳酸，證明葡萄糖的積累會對菌株生產(chǎn)L-乳酸產(chǎn)生負面的影響.為驗證Mg2+與Mn2+離子的作用，在第78 h時分別加入0.07 g的MnSO4·H2O和0.04 g的MgCl2·6H2O.78 h以后，L-乳酸的產(chǎn)率開始回升，于144 h達到第2階段的最高峰0.89 g/(L·h)，最終的糖酸轉(zhuǎn)化率為82.31%.這說明，Mn2+和Mg2+確實有助于細胞抵抗較高的滲透壓，提高了L-乳酸的產(chǎn)率.同時由于發(fā)酵過程中不停地補充空氣，所以，可認為Mn2+還有助于抵抗細胞中的過氧化物的傷害，維護電子傳遞鏈及代謝通路的暢通，Archibald[15]和馬瑞等[16]的研究也得到了類似的結(jié)論.但是，Ohkouchi等[12]認為，Mn2+的加入，有助于有機酸產(chǎn)率的提升卻對總產(chǎn)量沒有影響，這仍有待更深入地研究.

圖6 分批補料發(fā)酵L-乳酸和葡萄糖的含量變化

Fig.6 Changes ofL-lactic and glucose in culture by fed-batch method

2.5 以玉米淀粉為原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的規(guī)律

圖7 同步糖化發(fā)酵時L-乳酸和葡萄糖的含量變化

3 結(jié)論

BCS 13002具有耐高溫、營養(yǎng)因子要求低等特點，培養(yǎng)基可以不滅菌直接進行發(fā)酵，而且，BCS 13002生產(chǎn)的L-乳酸光學純度高達99.8%以上，無需再用基因工程等手段對菌株進行調(diào)整，十分適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求.本研究通過一系列實驗得到BCS 13002的最優(yōu)培養(yǎng)條件.以NaOH作為中和劑的效果優(yōu)于使用CaCO3和Ca(OH)2作為中和劑.BCS 13002可分別利用木糖、葡萄糖和玉米淀粉生產(chǎn)有機酸，但以木糖和玉米淀粉作為原料時，產(chǎn)物主要以乙酸為主，以葡萄糖和玉米淀粉水解液為碳源時，主要生產(chǎn)L-乳酸.在5 L發(fā)酵罐中，以玉米淀粉為原料，配合適當?shù)念A處理手段，以分批補料、同步糖化的發(fā)酵方式，可以替代葡萄糖，生產(chǎn)L-乳酸.以葡萄糖為碳源分批補料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，總產(chǎn)量為115.86 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率約為82.31%，以玉米淀粉為原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，總產(chǎn)量為123.3 g/L，由于有CO2生成，糖酸轉(zhuǎn)化率約為70.03%.

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