齊軍茹 曹靜 程萌 翁靜宜 張曦 楊曉泉

(華南理工大學 食品科學與工程學院, 廣東 廣州 510640)

基于Maillard反應(yīng)機理的蛋白質(zhì)和多糖糖基化研究是蛋白質(zhì)化學改性的一種綠色有效方法,因其具有較高的接枝度和安全性而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[1- 3].該方法通過控制溫度和相對濕度[4- 5]產(chǎn)生自發(fā)的Maillard反應(yīng),生成的糖基化蛋白的溶解性、乳化性、凝膠特性、抗氧化性、抗菌性以及熱穩(wěn)定性等性能均有提高[6- 11].通過Maillard反應(yīng)得到的蛋白質(zhì)-多糖糖基化產(chǎn)物的性質(zhì)主要依賴于蛋白的結(jié)構(gòu)和多糖的性質(zhì),例如,親水性、黏度、分子鏈長和參與糖基化反應(yīng)的數(shù)量[12].

近年來,國內(nèi)外該研究領(lǐng)域中所涉及的多糖多為中性多糖,如葡聚糖,以及其他小分子的多糖.Diftis等[5、13- 15]對大豆分離蛋白與多糖(葡聚糖、羥甲基纖維素)的共價接枝產(chǎn)物做了一系列研究.但是,制備產(chǎn)物未能獲得更加理想的物化性質(zhì).隨著多糖研究的迅速發(fā)展,可溶性大豆多糖作為一種綠色的食品添加劑受到關(guān)注.與葡聚糖不同,大豆可溶性多糖(SSPS)是一種酸性多糖,半乳糖醛酸主鏈上分布著阿拉伯糖中性側(cè)鏈[16],結(jié)構(gòu)類似于果膠,并且具有調(diào)節(jié)血糖值和血液脂質(zhì)、促進腸道有害物質(zhì)的吸附與排泄、抗癌、促進礦物質(zhì)吸收利用[17]等生物活性.研究表明,SSPS在酸性條件下具有良好的分散穩(wěn)定性,具有穩(wěn)定低黏度乳酸飲料的效果[18].這主要是由于SSPS中性糖側(cè)鏈的空間位阻作用使蛋白液滴穩(wěn)定.由此,筆者利用SSPS這一特性,使其與蛋白發(fā)生糖基化共價接枝,以使得到的共價接枝物在蛋白等電點區(qū)域 (pH4.5～5.0) 的各種物化性得到提升.這是因為葡聚糖分子糖鏈不帶電荷，通過Maillard反應(yīng)共價鍵接枝到蛋白分子表面的葡聚糖分子極其有限,大分子之間過低的接枝度使得葡聚糖對蛋白的物性修飾有很大的局限性,而SSPS屬于陰離子多糖,其具有靜電相互作用和空間位阻效應(yīng),兩者在蛋白修飾中共同發(fā)揮作用,可以預期共價接枝物(SSC)將可能獲得高的接枝度，并在酸性條件下同樣具備優(yōu)越的功能性.目前，SSPS與蛋白共價接枝產(chǎn)物及表征方面的研究在國內(nèi)外鮮有報道.隨著SSPS提取工藝的完善和其廣泛應(yīng)用,蛋白-可溶性大豆多糖糖基化產(chǎn)物將會受到更大的關(guān)注.因此， SSPS在蛋白物性修飾方面的應(yīng)用是一個值得研究的方向.

本研究根據(jù)pH4.5和pH6.5下的溶解度將產(chǎn)物分離分級,通過對蛋白質(zhì)-多糖共價接枝物(PPC)及其對照樣間的物化性質(zhì)的差異分析,探討了大豆分離蛋白-大豆多糖糖基化產(chǎn)物具有優(yōu)異功能特性的原因.

1 實驗材料和方法

1.1 材料

低溫脫脂豆粕購自山東嘉華保健品有限公司;可溶性大豆多糖B型(149～676 ku)購于福建泉州味博有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) 購于美國Sigma-Aldrich公司;其他生化試劑均為分析純.實驗用水為去離子水,電阻為15 MΩ.

1.2 實驗儀器

Himac CR 22G型高速冷凍離心機、F- 7000型熒光分光光度計,日本Hitachi公司;Alpha- 4型冷凍干燥機,德國Christ公司;Rapid N型Dumas定氮儀 ,法國Elementar公司;DYCZ- 30型垂直板電泳儀,北京六一儀器廠;UV2300型紫外可見分光光度計，上海天美公司;Nano- ZS型激光動態(tài)粒度掃描儀,英國Malvern公司;MultiMode SPM型原子力顯微鏡,美國Veeco 公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

大豆分離蛋白(SPI)根據(jù)文獻[19- 20]的方法從低溫脫脂豆粕中分離而得.杜馬斯燃燒法測定其蛋白質(zhì)含量為(83.621±0.352)% (蛋白質(zhì)換算系數(shù)=5.71干基).

1.3.2 SSC的制備

根據(jù)前期的單因素試驗中電泳結(jié)果[21],選擇適宜的制備參數(shù).將SPI與SSPS按1∶1的質(zhì)量比混合后分散于磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L，pH=6.8) 中，使其質(zhì)量濃度各達100 g/L.室溫下攪拌2 h,冷凍干燥.干燥后的粉末過篩孔尺寸為0.125 mm的篩網(wǎng).將凍干粉末放入底部裝有飽和KBr溶液的干燥器中,置于60 ℃的烘箱中反應(yīng)7 d.所得產(chǎn)物按一定的質(zhì)量比(1∶10)加入去離子水,攪拌使其充分溶解.用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5,攪拌2 h后于10 000g下離心30 min.得到的上清液回調(diào)pH值至6.5,冷凍干燥后得到組分SC45.沉淀以質(zhì)量比1∶10復溶于去離子水中,回調(diào)pH值至6.5,10 000g下離心30 min,冷凍干燥后得到組分SC65,置于干燥器中保存?zhèn)溆?

采用Dumas法測得凍干的SC45和SC65樣品中蛋白質(zhì)含量分別為8.502%和26.195%.接枝物SC45和SC65各自所占比例為(57.3±3.0)%和(25.4±3.4)%.

1.3.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳

依據(jù)Laemmli的方法進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[22].將樣品置入樣品緩沖液中(0.125 mol/L Tris-HCl緩沖液,含1%(質(zhì)量分數(shù))SDS、5%(體積分數(shù))甘油、2%(體積分數(shù))2-巰基乙醇(2-ME)和0.025%(質(zhì)量分數(shù))溴酚藍),電泳前煮沸5 min,10 000g離心10 min,取上清液上樣,上清液中蛋白質(zhì)含量為2.0 mg/mL,上樣量為5 μL.分離膠質(zhì)量濃度為13%,濃縮膠質(zhì)量濃度為5%.凝膠電泳于恒定電流下進行,樣品在濃縮膠中的電流設(shè)定為20 mA,樣品進入濃縮膠與分離膠界面后,將電流調(diào)節(jié)為40 mA,當電泳跑至距離電泳槽橡膠底邊約1.5 cm時,關(guān)閉電源.分別用考馬斯亮藍R-250試劑和PAS染色法對凝膠膠片進行蛋白質(zhì)及糖染色[23].脫色完成后,對膠片拍照并進行分析.

1.3.4 接枝度測定

采用三硝基苯磺酸(TNBS)法測定SSC的接枝度.將蛋白含量為1 mg/mL的0.5 mL待測樣品、0.5 mL 4%的NaHCO3溶液、0.5 mL 10%的SDS溶液、0.5 mL 0.1%的TNBS溶液混合均勻,40 ℃中避光反應(yīng)2 h后加入1 mol/L的HCl溶液0.25 mL和0.01 mol/L的HCl溶液2.25 mL,終止反應(yīng)并于340 nm處測定其吸光度.

接枝度的計算公式為

1.3.5 巰基含量測定

根據(jù)Ellman法[24].將1 mL蛋白質(zhì)量濃度為10 g/L的樣品溶液添加到4 mL含1 mol/L尿素和0.01 mol/L乙二胺四乙酸 (EDTA) 的Tris-甘氨酸緩沖液 (0.1 mol/L，pH 8.0) 中.然后放入40 ℃水浴30 min,立即加入125 μL 2-硝基苯甲酸(DTNB)試劑 (20 mg DTNB溶于5 mL Tris-甘氨酸緩沖液中).在室溫下放置10 min后,于412 nm處測定樣液吸光值.總巰基含量的計算公式表示如下：

SH=73.53D412R/ρ.

式中:D412表示樣品的吸光值;R表示稀釋倍數(shù),為5.125;ρ表示蛋白質(zhì)量濃度,為10 mg/mL.

1.3.6 濁度測定

根據(jù) Damodaran等[25]的方法.分別稱取一定量的SPI、混合物和糖基化產(chǎn)物溶于不同pH值的水溶液中 (樣品蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL),于540 nm處測定吸光值.

1.3.7 動態(tài)光散射測試

SPI、混合物和糖基化產(chǎn)物(蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL)的表觀流體力學直徑(dh)采用Zetasizer Nano-ZS儀器進行測量.樣品溶解于5 mmol/L pH =7.0的磷酸緩沖液中,測量前不過濾,在25 ℃下測量3次取平均值.

樣品的Zeta電位同樣采用Zetasizer Nano-ZS儀器測量.激光器為4 mV的He-Ne激光器,入射波長為633 nm,于25 ℃下測量3次取平均值.

1.3.8 原子力顯微鏡測試

取2 μL樣品溶液 (蛋白質(zhì)量濃度為10 μg/mL) 分散于新鮮剝離的干凈云母片上,室溫下風干后使用MultiMode SPM 顯微鏡(Digital Instruments,Veeco,Santa Barbara,CA) 觀察.樣品溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾.測試用輕敲模式 (Tapping Mode) 成像.操作條件:掃描速度為1.0 Hz;頻率為320 kHz;共振頻率為290 kHz ;硅針尖的長度為125 μm,曲率半徑為42 N/m (PointProbe NCHR，瑞士 NanoWorld 公司).使用 Digi-tal Nanoscope 軟件 (version 5.30r3,Digital Instruments,Veeco) 對原子力顯微鏡(AFM)圖片進行處理及分析.AFM圖片中粒徑分布曲線使用濾膜過濾后的樣品測定.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE鑒定SSC的形成,結(jié)果如圖1所示.圖1A部分中泳道2和圖1B部分中泳道2都是典型的SPI特征條帶.由蛋白染色中泳道4可見,帶有負電荷的SSPS與SPI混合產(chǎn)物(SSM,未加熱,下同)沒有對SPI的特征條帶產(chǎn)生影響,同時也說明沒有經(jīng)過干熱反應(yīng)的混合物不會生成共價接枝物.在圖1A部分中，SC45和SC65兩組分條帶中7S(α′、α、β)和11S(AS、BS)球蛋白條帶均變淺,7S球蛋白條帶幾乎消失.在圖1B部分中,與SPI及SSM條帶相比,泳道5、6的分離膠頂端及其與濃縮膠之間均有較大相對分子質(zhì)量的物質(zhì)產(chǎn)生,蛋白染色和糖染色結(jié)果均說明SPI與SSPS發(fā)生了共價交聯(lián),生成高相對分子質(zhì)量的糖蛋白.由于接枝物的接枝度較高,為得到清晰的圖譜，選取較少的上樣量,取5 μL,故糖蛋白在上樣液中含量較低，在糖染色中整體條帶較淺.SPI經(jīng)過加熱處理(60 ℃、相對濕度為79%的條件下加熱7 d)后,蛋白染色圖譜(圖1A部分泳道3)中7S球蛋白明顯減少,并在圖譜頂端形成分散性掃尾帶,說明單純的SPI干熱條件下自聚集程度較高;但是,與7S球蛋白-葡聚糖糖基化產(chǎn)物和SPI-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物相比[19，26],SSC的兩個組分條帶頂端均無掃尾帶(圖1A部分泳道5和6),說明相同反應(yīng)條件下,SSPS能夠有效減弱蛋白聚集.

與SC65組分相比,SC45組分蛋白染色條帶(圖1A部分中泳道5)稍淺,且在糖蛋白染色中分離膠頂端顏色較深,而SC65組分在圖1B部分泳道6的下端形成較長分散性條帶,這與糖基化產(chǎn)物接枝度的結(jié)果相同.

圖1 蛋白質(zhì)染色和糖染色的SDS-PAGE圖譜

Fig.1 SDS-PAGE patterns with protein staining and carbohydrate staining

2.2 接枝度分析

蛋白質(zhì)中游離氨基參與Maillard反應(yīng)是對蛋白質(zhì)側(cè)鏈修飾的一種主要方法.本研究通過測定接枝度的變化來反映游離氨基的變化情況,進而表征Maillard反應(yīng)的程度.

SC45和SC65兩組分有很高的接枝度,分別為(41.79±0.62)%和(36.75±1.76)%.一般情況下,SPI與麥芽糊精的接枝度最高達26.46%,而7S球蛋白與葡聚糖接枝物可達28.61%[19].可能由于SSPS與蛋白帶有相反電荷以及其側(cè)鏈提供的空間位阻作用,SSC減少了SPI熱聚集,使得SPI中更多游離的氨基酸基團連接到多糖分子的還原端.

2.3 巰基含量分析

為了探索不同pH條件下制備的糖基化產(chǎn)物對蛋白聚集行為的影響,對SSC及其對照樣的總巰基含量進行了測定.尿素能破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵,導致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)松弛,肽鏈伸展開來,從而使原來包藏在分子內(nèi)部的巰基暴露.SPI的巰基含量為(6.78±0.38)μmol/g，加入SSPS后混合物的巰基含量較SPI有所增加,為(7.80±0.10)μmol/g.可能是由于SPI在溶液中伸展開來的肽鏈有一定程度的團聚,使巰基與DTNB反應(yīng)減少,而SPI與SSPS在緩沖溶液中的靜電相互作用減弱了SPI伸展開來的肽鏈的團聚.

SC45和SC65兩組分巰基含量相差不大,分別為(16.96±0.76)μmol/g和(17.32±0.06)μmol/g,但比SPI和SSM的顯著增加.結(jié)合之前接枝度和SDS-PAGE的結(jié)果可知,產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是：在糖基化過程中,連接7S球蛋白和11S球蛋白亞基間的二硫鍵發(fā)生了斷裂,生成了更多的巰基.與張曦等[26- 27]研究的7S球蛋白與葡聚糖糖基化產(chǎn)物的物化性質(zhì)相比,SSC具有更高的巰基含量,說明SSPS對SPI具有獨特的修飾作用.SC65的糖基化程度相對較低,生成的巰基暴露在蛋白分子表面,容易被檢測;而SC45糖基化程度較高,蛋白分子表面鏈接的多糖數(shù)目較大,蛋白分子能被完整地包裹在多糖鏈中,可能干擾巰基的測定,使結(jié)果偏低.

SSPS和SPI發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的同時明顯減弱了蛋白質(zhì)因二硫鍵形成導致的聚集行為.另一方面,在食品加工過程中,蛋白表面巰基相對含量的變化是影響蛋白凝膠彈性和強度的重要因素.不斷加熱的條件下,分布于蛋白表面的巰基化學活性增強,分子之間發(fā)生巰基-二硫鍵相互轉(zhuǎn)化,使得先前形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由共價鍵進一步得到穩(wěn)固,從而將溶液包含于凝膠內(nèi)部.研究表明單純的熱制及冷制蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較差[28- 30],且蛋白質(zhì)過度的聚集不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的有效形成.因此根據(jù)筆者的實驗結(jié)果可以進一步推斷,SC65的凝膠性能可能比SC45要好,這也給后續(xù)研究提供了指導方向.

2.4 濁度分析

圖2示出了共價接枝物和SPI在不同pH條件下的濁度變化.濁度反映了溶液體系中不同懸浮顆粒的大小和數(shù)量,常被作為蛋白質(zhì)聚集的指標.當?shù)鞍踪|(zhì)聚集至一定程度,溶液中顆粒直徑變大,溶液濁度升高[31- 32].由圖可知,SPI在其等電點pH4.5附近濁度最大,SSM濁度在SPI等電點附近顯著降低,SSPS對蛋白聚集有良好的削減作用.這可能由于SSPS在酸性條件下具有較好的分散穩(wěn)定性,它的空間位阻作用和靜電相互作用使得混合物的濁度整體較低[19].

圖 2 共價接枝物和對照樣的濁度

與SPI相比,SC45和SC65在pH4.5附近的濁度均小于單純蛋白質(zhì),但SC45和SC65兩組分在酸性環(huán)境中濁度差異較大.SC65的濁度最高點前移,使得SPI的等電點向酸性方向偏移,并且在pH4.5附近溶解時,濁度顯著高于SC45.這種現(xiàn)象的主要原因可能是蛋白-多糖的靜電相互作用.在酸性條件下,SC45濁度最低,在不同pH條件下濁度幾乎沒有變化.SC45在pH4.5附近的溶解性能好,故濁度低,可能原因是接枝度較高,并且其中性側(cè)鏈的空間位阻作用較強.但在中性環(huán)境中,SC45和SC65的濁度都略高于蛋白及其混合物,說明糖基化反應(yīng)過程中生成了大分子共價復合物.

資料表明,糖基化有利于降低pH誘導的大豆分離蛋白的聚集行為[33].溶液體系 pH 的變化導致蛋白質(zhì)分子電荷的變化,蛋白質(zhì)在等電點時,以兩性離子的形式存在,蛋白質(zhì)分子總靜電荷為零,蛋白質(zhì)顆粒在溶液中沒有電荷間的排斥作用,因而最不穩(wěn)定,溶解度最小,蛋白質(zhì)因疏水作用的驅(qū)動形成聚集體,因此SPI在等電點附近濁度最明顯.當?shù)鞍踪|(zhì)肽鏈上共價接入糖鏈后,多羥基的親水特性顯著提高了蛋白質(zhì)分子的溶解性能,并且多糖鏈引入的空間位阻效應(yīng)也減弱了蛋白質(zhì)分子由于靜電吸引而聚集的能力[34].

2.5 粒徑及Zeta電位分析

本研究結(jié)合動態(tài)光散射(DLS)與Zeta電位分析SSC在溶液中的穩(wěn)定性.SPI、SSM、SC45和SC65的粒徑分別為(69.56±3.17)、(77.43±0.21)、(241.05±4.22)、(78.81±0.71)nm,電位為(-37.1±1.51)、(-32.9±0.59)、(-14.7±0.62)、(-26.5±0.97)mV.與SPI相比,SPI在發(fā)生Maillard反應(yīng)后生成的共價接枝物的Zeta電位絕對值均變小,這可能是因為共價接枝的SSPS主要覆蓋在蛋白表面,一定程度上起到了屏蔽作用.結(jié)合DLS和接枝度分析可知,蛋白分子表面SSPS分子的覆蓋率越大,屏蔽作用越明顯,Zeta電位絕對值越小.在濁度測定的pH范圍內(nèi),SC45濁度低,SC65濁度較高,而二者的電位絕對值結(jié)果與其相反,這說明糖基化產(chǎn)物體系的穩(wěn)定性不是由電荷作用決定的,而是由接入的SSPS分子的親水側(cè)鏈及空間位阻作用決定的.

2.6 形貌學分析

本實驗用AFM和DLS來研究糖基化對SPI聚集行為的影響.如圖3(a)所示,SPI呈球狀形態(tài),樣品分布相對均勻,大的顆?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)輕度自身聚集所致.圖3(b)為SSM的AFM照片,平均粒徑比SPI稍大,聚集行為較為明顯.在SC45的AFM圖像中(見圖3 (c) )存在大量大分子,蛋白表面被糖基化的多糖占據(jù),并且在糖基化產(chǎn)物周圍還存在一定量的游離多糖,這與SC45中蛋白含量和接枝度測定結(jié)果一致.DLS結(jié)果顯示，SC45平均粒徑為241.05 nm,并且粒子大小均一,溶液較為穩(wěn)定,這與SSPS結(jié)構(gòu)的親水性質(zhì)以及空間位阻作用密不可分.SC65中同樣沒有出現(xiàn)明顯聚集現(xiàn)象,平均粒徑較SC45小.

圖3 SPI、SSM、SC45和SC65的AFM圖像及粒徑分布

Fig.3 AFM images and particle size distributions of SPI,SSM,SC45 and SC65

3 結(jié)論

本研究用干熱法制備SSC,根據(jù)糖基化產(chǎn)物在 SPI 等電點附近和中性條件下的溶解性差異進行分離分級.通過 SDS-PAGE和AFM，從接枝度、巰基含量、濁度、動態(tài)光散射粒度和Zeta電位等方面探討了糖基化產(chǎn)物物化性質(zhì)的差異,得出以下結(jié)論:

(1)SSC的兩種組分的接枝度分別為(41.79±0.62)%和(36.75±1.76)%,總巰基含量為(16.96±0.76)μmol/g和(17.32±0.06)μmol/g;

(2)接入的SSPS分子的親水側(cè)鏈及空間位阻作用決定了糖基化產(chǎn)物的穩(wěn)定性;

(3)SSPS對蛋白的糖基化修飾能夠有效抑制SPI分子間的熱聚集.

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