■文/諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 莊夕棟

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)及其在病毒性豬病快速檢測(cè)中的應(yīng)用

■文/諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 莊夕棟

重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)是近年來(lái)建立起來(lái)的一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、在短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增出目的片段等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疾病早期診斷、現(xiàn)地檢測(cè)、進(jìn)出口快速檢疫等方面具有良好的應(yīng)用前景。文章綜述了RPA技術(shù)及其在病毒性豬病快速檢測(cè)中的最新應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為更好地防控豬病提供參考。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)；豬??；檢測(cè)

重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的有望替代PCR的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。RPA技術(shù)由Piepenburg等[1]于2006年創(chuàng)立，該技術(shù)基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增原理，體外模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制，在恒溫條件下即可對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增[2]，特別適用于快速檢測(cè)、體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]，已被成功應(yīng)用到多種病原的快速檢測(cè)上。本文現(xiàn)將RPA技術(shù)及其在病毒性豬病快速檢測(cè)中的最新應(yīng)用綜述如下。

1 RPA技術(shù)

RPA該技術(shù)主要依賴于3種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶[4]。這3種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37℃左右。反應(yīng)過(guò)程中不需要模板鏈的熱變性，可以在恒定的低溫條件下10～20min內(nèi)快速擴(kuò)增目的DNA或者RNA[5]。隨后，英國(guó)TwistDx公司開(kāi)發(fā)出了商品化試劑盒，加快了RPA技術(shù)的研發(fā)、推廣和應(yīng)用[6]。與傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相比，RPA技術(shù)具有擴(kuò)增速度快、反應(yīng)溫度恒定、所需儀器簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、結(jié)果確實(shí)可靠、可制作成側(cè)流層析試紙條(LFD)等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，有望替代PCR。目前，RPA技術(shù)已經(jīng)在病毒、衣原體、支原體、細(xì)菌、寄生蟲等病原檢測(cè)方面得到了開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[7]。

2 RPA技術(shù)在病毒性豬病檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 口蹄疫

口蹄疫(Foot and Mouse Disease，F(xiàn)MD)是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)引起的一種偶蹄動(dòng)物共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，被國(guó)際獸疫局(OIE)列為A類疾病。Abd等[8](2013)將RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶，在RPA基因擴(kuò)增與熒光檢測(cè)儀中進(jìn)行RT-RPA，應(yīng)用到FMDV的檢測(cè)當(dāng)中，可以檢測(cè)到FMDV的所有的7個(gè)血清型，而且各型之間沒(méi)有發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，靈敏性高。Amer等[9](2013)研發(fā)出一種可以在4～10min內(nèi)檢測(cè)到FMDV的實(shí)時(shí)RT-RPA，靈敏度高達(dá)98%。此技術(shù)成功應(yīng)用于當(dāng)年埃及的口蹄疫大暴發(fā)時(shí)期，有效抑制了疫情的蔓延。王紅梅等[10](2016)利用最新的RPA技術(shù)，結(jié)合LFD方法，建立了可用于O型、A型和AsiaⅠ型FMDV的通用型和血清型分型的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)。在25min內(nèi)即可完成RPA反應(yīng)，靈敏度可達(dá)到1TCID50。楊洋等[11](2017)根據(jù)O型FMDV ON毒株3D基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，建立了實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(real-time RT-RPA)檢測(cè)方法，在40℃恒溫條件下20min內(nèi)可快速、特異地檢測(cè)FMDV。利用該方法對(duì)采集的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有100%的符合率。RPA技術(shù)為FMDV的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一種靈敏、可靠的新方法，為口蹄疫疫情的診斷及預(yù)報(bào)提供了技術(shù)支持。

2.2 豬細(xì)小病毒病

豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎兒死亡、重吸收、流產(chǎn)、木乃伊胎等，但母豬不表現(xiàn)明顯的癥狀。Yang等[12](2016)研制了檢測(cè)PPV NS1基因的熒光定量RPA和LFD方法，最低可分別檢測(cè)到300和400個(gè)含NS1基因的重組質(zhì)粒，平行檢測(cè)101份病料和27份陰性樣品，熒光定量RPA和LFD與熒光定量PCR結(jié)果符合率分別為94.4%和100%。

2.3 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)是引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)為代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周齡的仔豬。PCV2的感染呈世界性分布，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要病因之一。PCV2感染可以導(dǎo)致動(dòng)物免疫抑制，從而增強(qiáng)對(duì)其他多種病原體的易感性，使病情更加復(fù)雜化。Wang等[13](2016)建立了檢測(cè)PCV-2的實(shí)時(shí)熒光定量RPA方法。該方法最低可檢測(cè)100個(gè)PCV-2基因組，靈敏度與熒光定量PCR相同，較普通PCR提高了10倍。平行檢測(cè)48份病料樣品，RPA與熒光定量PCR結(jié)果一致，與普通PCR符合率為93.7%(45/48)。

2.4 豬藍(lán)耳病

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)又 稱 豬 藍(lán) 耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，在世界范圍內(nèi)的豬場(chǎng)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。Yang等[14](2016)研制了檢測(cè)高致病性豬藍(lán)耳病病毒(HPPRRSV)的熒光定量RPA方法。該方法最低可檢測(cè)到70個(gè)目的基因的重組質(zhì)粒，平行檢測(cè)125份臨床樣品，熒光定量RPA與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果敏感性和特異性分別為97.6%和100%。

2.5 豬流行性乙型腦炎

豬流行性乙型腦炎又名日本乙型腦炎，是由日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的一種急性人獸共患傳染病。豬主要特征為高熱、流產(chǎn)、死胎和公豬睪丸炎。梁輝[15](2016)建立了JEV的RT-RPA-LFD的快速檢測(cè)方法，20～25min即可獲得穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判定準(zhǔn)確直觀的優(yōu)點(diǎn)，適合用于JEV現(xiàn)地檢測(cè)和在基層推廣應(yīng)用。而且T-RPA-LFD檢測(cè)方法可以用于多種JEV分離株的檢測(cè)，方便攜帶，適用性強(qiáng)。

2.6 其他豬病

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。臨床癥狀與豬瘟極其相似，以高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，是我國(guó)一類動(dòng)物疫病和OIE規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物疫病。王建昌等[16](2016)基于ASFV VP72基因保守序列設(shè)計(jì)并合成引物，建立了ASFV的RPA檢測(cè)方法，在38℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)30min，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的有效擴(kuò)增，為ASFV的一線防控提供了一種新的、可靠的技術(shù)支持。

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus，SVV)又 稱 為 Senecavirus A(SVA)，是豬原發(fā)性皰疹病(Swine Idiopathic Vesicular Disease，SIVD)的主要病原，可感染豬，引起類似FMDV感染造成的水皰性病變。SVV感染豬群后，盡管不會(huì)造成與FMDV相同的較大政治、經(jīng)濟(jì)損失，但所引起的水皰性病變與口蹄疫、豬水皰病、水皰性口炎、豬水皰疹等造成的病變相似，給臨床鑒別診斷造成了一定的困難。樊曉旭等[17](2017)利用RPA技術(shù)，針對(duì)SVV 3D基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立了實(shí)時(shí)熒光RPA方法，在40℃、10min內(nèi)檢測(cè)的最低濃度為28拷貝/μL。該等溫快速擴(kuò)增方法為豬群出現(xiàn)水皰性疾病的鑒別診斷提供了技術(shù)支持，對(duì)及時(shí)采取適當(dāng)防控措施具有重要意義。

3 前景與展望

我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模巨大，產(chǎn)值高，但是各種病害不斷出現(xiàn)，嚴(yán)重制約著我國(guó)畜牧業(yè)的健康發(fā)展。近些年來(lái)，隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新，動(dòng)物病原的檢測(cè)方法取得了前所未有的發(fā)展，但各種方法或因成本過(guò)高難以推廣，或因靈敏度過(guò)低無(wú)法達(dá)到檢測(cè)要求，或因耗時(shí)耗力不實(shí)用。RPA結(jié)合了血清學(xué)和分子技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，并克服了兩種方法的缺點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)單、快速、性價(jià)比高的診斷工具，在動(dòng)物疾病早期診斷、現(xiàn)地檢測(cè)、進(jìn)出口快速檢疫等方面具有巨大的應(yīng)用前景和市場(chǎng)[18～20]。以RPA技術(shù)為基礎(chǔ)建立的RPA-ELISA、on-chip RPA等擴(kuò)增技術(shù)可以高通量自動(dòng)化檢測(cè)多種病原體，提高檢測(cè)效率[21]。另外，RPA技術(shù)在癌癥突變檢測(cè)、遺傳病的定期和快速普查、動(dòng)物食品安全衛(wèi)生、轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)等領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景[22～25]。雖然目前RPA技術(shù)的檢測(cè)成本高于PCR等其他核酸擴(kuò)增技術(shù)，但隨著RPA技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展、完善以及生產(chǎn)工藝的改良，RPA技術(shù)有望成為常規(guī)的快速診斷手段，并在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用?！?/p>

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