陳鍇 魯仁義 閻瀾

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅學(xué)員十隊(duì)，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

·綜述·

白念珠菌致病因素及抗真菌藥物研究進(jìn)展

陳鍇1魯仁義2閻瀾2

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅學(xué)員十隊(duì)，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

白念珠菌是常駐人體的條件致病真菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時會引起皮膚黏膜淺層乃至全身系統(tǒng)性真菌感染。目前，念珠菌血癥是引起院內(nèi)血源性感染的第4位因素。隨著經(jīng)典藥物耐藥性的出現(xiàn)，因侵襲性念珠菌病死亡的患者也日漸增多。為解決真菌感染及耐藥性的問題，越來越多從白念珠菌致病因素出發(fā)的新型抗真菌藥物正在火熱研發(fā)。該文對抗真菌藥物的研究進(jìn)展作一綜述。

白念珠菌；抗真菌藥物；生物被膜；菌絲

隨著病原真菌耐藥現(xiàn)象日漸嚴(yán)重，經(jīng)典抗真菌藥物已無法滿足控制疾病的要求。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，侵襲性念珠菌病在全球范圍內(nèi)的影響已達(dá)25萬人/年，死亡案例超過5萬人[1-2]。目前，念珠菌血癥已成為醫(yī)療相關(guān)血流感染 (Bloodstream infection，BSI)的第4位最常見原因，并且是重癥監(jiān)護(hù)室重癥感染的首位病因[3]，新型抗真菌藥物的研發(fā)迫在眉睫。

1 白念珠菌的致病因素

白念珠菌 (Candidaalbicans)是一種定植于人體的條件致病真菌。在免疫力正常的人體，白念珠菌定植在淺表皮膚和黏膜，不致??；當(dāng)機(jī)體由于應(yīng)激、嚴(yán)重感染或使用免疫抑制劑而導(dǎo)致免疫功能下降時，白念珠菌易侵襲人體，引起黏膜甚至深部器官真菌感染。

白念珠菌的致病因素主要包括形態(tài)轉(zhuǎn)換、黏附、分泌水解酶、生物被膜、群體感應(yīng)等多種因素[4]。白念珠菌具有酵母相、菌絲相、假菌絲相等形態(tài)，其中菌絲相更具侵襲力，而酵母相細(xì)胞更易傳播。白念珠菌通過感知環(huán)境pH、營養(yǎng)、金屬離子等因素，能對其形態(tài)進(jìn)行調(diào)控轉(zhuǎn)換，從而適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境。當(dāng)白念珠菌侵襲人體時，菌絲表面黏附素 (Hwp1p)和侵襲素 (Als3p、Ssa1p)會與宿主上皮細(xì)胞的相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)黏附；同時，菌絲尖端分泌水解酶 (Sap2)和溶解素 (candidalysin)，侵襲和破壞宿主上皮細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜通透性增加，減弱宿主細(xì)胞的防御能力[5]。生物被膜是附著在非生物或生物表面的微生物群落[6]。成熟的生物被膜由白念珠菌酵母、菌絲及細(xì)胞外基質(zhì)組成，菌絲相細(xì)胞附著于基質(zhì)表面，酵母相細(xì)胞被包埋在聚合細(xì)胞外基質(zhì)中難以清除，容易導(dǎo)致真菌從成熟生物被膜釋放，引起持續(xù)性念珠菌病。與浮游細(xì)胞不同，白念珠菌生物被膜對于多種臨床抗真菌藥物均有耐受性，是目前抗真菌藥物研究的主攻方向之一。

2 經(jīng)典抗真菌藥物

經(jīng)典抗真菌藥物主要包括三種：多烯類、唑類以及棘白菌素類抗真菌藥。

2.1 多烯類

以兩性霉素B為代表的多烯類抗真菌藥物是具有疏水和親水性的兼性分子，通過緊密結(jié)合麥角甾醇以產(chǎn)生插入真菌細(xì)胞膜形成跨膜通道的藥物-脂質(zhì)復(fù)合物[7]，從而增加細(xì)胞膜通透性，使胞內(nèi)小分子外泄造成細(xì)胞死亡。目前，多烯類藥物在臨床效果良好，但長期使用會造成肝、腎毒性，因而其長期應(yīng)用受到限制。

2.2 唑類

唑類抗真菌藥物是一類五元含氮雜環(huán)化合物，主要通過抑制由ERG11編碼的真菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶 (也稱細(xì)胞色素P450)而減少真菌細(xì)胞膜麥角甾醇的合成[8]。唑類藥物通過易化擴(kuò)散進(jìn)入真菌細(xì)胞，并通過唑環(huán)中的無阻氮原子與位于Erg11p蛋白活性位點(diǎn)卟啉上的鐵原子結(jié)合起作用。有資料顯示，唑類藥物還能通過破壞液泡膜質(zhì)子泵酶而打破液泡內(nèi)的陽離子穩(wěn)態(tài)。唑類藥物對酵母菌具有抑制效果，而對霉菌具有殺菌效果[9]，正是因?yàn)閷δ钪榫囊志菤⒕饔茫瑢?dǎo)致其耐藥性的產(chǎn)生。

2.3 棘白菌素類

棘白菌素是一種抑制葡聚糖合酶的脂肽大分子，通過破壞β-(1,3)-D-葡聚糖的合成造成真菌細(xì)胞壁完整性的缺失，最終起到殺滅真菌的作用[10]。研究表明，棘白菌素類藥物具有較好的抗念珠菌生物被膜活性，生理血液濃度的米卡芬凈在體外抗念珠菌生物被膜活性較高，而卡泊芬凈可抑制細(xì)胞黏附于材料表面、改變被膜內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)和代謝狀態(tài)[9]。此外，這類藥物還可以通過影響胞外多聚基質(zhì)降低生物被膜的耐藥性。

3 抗真菌藥物研究進(jìn)展

目前臨床侵襲性真菌感染的治療常采取預(yù)防用藥或經(jīng)驗(yàn)性用藥以及長周期用藥，這些治療方式導(dǎo)致真菌耐藥現(xiàn)象日漸嚴(yán)重。為了克服真菌感染的難題，從白念珠菌致病因素著手開展抗真菌藥物研究是一個有效途徑，現(xiàn)已取得一些進(jìn)展。

3.1 曲馬多

最新研究表明，鎮(zhèn)痛藥物曲馬多對白念珠菌的生長、形態(tài)轉(zhuǎn)換和生物被膜形成均具有抑制作用。曲馬多抗白念珠菌的50%最低抑菌濃度在2～4 mg/mL之間，而其殺菌濃度為8 mg/mL，且能殺死99.9%的真菌。通過BLASTp對白念珠菌蛋白質(zhì)組學(xué)的分析中，并沒有發(fā)現(xiàn)與μ型阿片肽受體相似的蛋白，但在白念珠菌致病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用的Gpr1p、Ste2p、和Ste3p與μ型阿片肽受體具有一定相似性[11]。其中Gpr1p能感知培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，來調(diào)節(jié)白念珠菌的形態(tài)發(fā)生，而Ste2p與Ste3p則是調(diào)節(jié)白念珠菌灰-白形態(tài)轉(zhuǎn)變的交配型信息素受體。曲馬多能夠抑制白念珠菌酵母向菌絲形態(tài)的轉(zhuǎn)變，主要通過靶向調(diào)節(jié)白念珠菌G蛋白耦聯(lián)受體 (GPCR)——Gpr1p/Gpa1p受體來實(shí)現(xiàn)。此外，曲馬多還能夠抑制細(xì)胞黏附到聚苯乙烯表面，這種抑制黏附的作用能有效抑制早期和成熟生物被膜的形成[12]。目前，曲馬多作為麻醉輔助藥物的安全性已被證實(shí)，同時也被認(rèn)可是潛在的抗真菌劑及抗念珠菌局部給藥的候選藥物，但其抗白念珠菌的臨床療效，仍有待進(jìn)一步的研究。

3.2 多胺生物合成抑制劑

多胺生物合成抑制劑與兩性霉素B的聯(lián)合使用能夠有效抑制白念珠菌生物被膜的生成。能夠消除白念珠菌生物被膜有效濃度的兩性霉素B往往具有嚴(yán)重肝腎毒性，而多胺在生物體內(nèi)參與細(xì)胞增殖、凋亡、基因調(diào)控、蛋白翻譯等多種生物學(xué)過程，兩性霉素B與多胺生物合成抑制劑，如1,4-二氨基-2-丁酮 (DAB)或二氟甲基鳥氨酸 (DFMO)聯(lián)合使用時，能夠起到有效抗生物被膜的作用[13]。這種聯(lián)合使用的作用機(jī)制，主要是能夠增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，并使半胱天冬酶編碼基因MCA1的轉(zhuǎn)錄水平以及半胱天冬酶的活性顯著提高[14-15]。

3.3 氟西汀

氟西汀與唑類藥物聯(lián)合使用被證實(shí)能夠協(xié)同抵抗白念珠菌的生物被膜，在體內(nèi)外均有活性。通過考察時間-殺菌曲線、蠟螟 (Galleriamellonella)模型實(shí)驗(yàn)，以及生物被膜形成4 h、8 h、12 h的狀態(tài)等[16]，研究發(fā)現(xiàn)氟康唑和氟西汀聯(lián)合使用抑制生物被膜的作用機(jī)理可能與SAP基因簇的下調(diào)和白念珠菌細(xì)胞外磷脂酶活性被抑制相關(guān)[17]，但仍需開展更深入的機(jī)制研究以及更多的動物模型以驗(yàn)證。

3.4 環(huán)孢菌素A

環(huán)孢菌素A是一種鈣依賴磷酸酶抑制劑，能夠通過多種機(jī)制提高白念珠菌生物被膜對氟康唑的敏感性。這種作用具有劑量依賴性，對于白念珠菌生物被膜形成的初期和成熟被膜都有抑制作用。環(huán)孢素A能夠使黏附相關(guān)基因ALS3和HWP1、細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白耐藥基因CDR1和MDR1、以及氟康唑靶基因ERG11的表達(dá)顯著下調(diào)[18]。流式細(xì)胞儀檢測表明，環(huán)孢菌素A與唑類藥物的聯(lián)合使用還具有降低細(xì)胞表面疏水性并增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用。但由于環(huán)孢菌素A是免疫抑制劑，其抗真菌的臨床用途還有待研究，因而，開發(fā)不具有免疫抑制作用的鈣依賴磷酸酶抑制劑是今后的研究熱點(diǎn)之一。

3.5 小檗堿

小檗堿和氟康唑聯(lián)合使用具有良好的協(xié)同抗耐藥白念珠菌的體外活性。時間-殺菌曲線顯示，這種協(xié)同作用具有小檗堿劑量依賴性，而并非氟康唑劑量依賴性。除小檗堿外，其他DNA嵌入劑，包括亞甲藍(lán)、血根堿和吖啶橙，均發(fā)現(xiàn)能協(xié)同氟康唑?qū)鼓退幇啄钪榫?。其主要機(jī)制與小檗堿能在白念珠菌細(xì)胞核內(nèi)積累，從而引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞周期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄改變有關(guān)[19]。熒光檢測胞內(nèi)積累的小檗堿發(fā)現(xiàn)，氟康唑能夠破壞真菌細(xì)胞膜而增加胞內(nèi)小檗堿濃度。但細(xì)胞內(nèi)小檗堿的外排作用卻與氟康唑無關(guān)，而具有強(qiáng)烈的葡萄糖依賴性，與細(xì)胞膜外排泵Cdr2p也密切相關(guān)。研究表明，在小檗堿與氟康唑協(xié)同作用中，小檗堿發(fā)揮主要的抗真菌作用，而氟康唑主要起著增加細(xì)胞內(nèi)小檗堿濃度的作用[20]。此外，有研究表明氟康唑和小檗堿聯(lián)合比唑類單一療法能更有效地治療淺表真菌感染，并且具有預(yù)防復(fù)發(fā)的優(yōu)勢[20]。但由于大劑量小檗堿靜脈輸注具有毒性作用，阻礙了這種協(xié)同作用在臨床上的應(yīng)用。

3.6 紫檀芪

紫檀芪是多種天然植物來源的二苯乙烯衍生的植物抗毒素。研究發(fā)現(xiàn)，16 μg/mL以下濃度的紫檀芪具有顯著的體外抗白念珠菌生物被膜活性[21]，其作用主要包括抑制生物被膜的形成和破壞已成形的生物被膜，而紫檀芪對浮游白念珠菌卻幾乎無殺菌效果?；虮磉_(dá)微陣列和實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果顯示，在16 μg/mL的紫檀芪作用下，白念珠菌中與形態(tài)轉(zhuǎn)變、麥角甾醇生物合成、氧化還原酶活性以及與細(xì)胞表面和蛋白質(zhì)變性 (熱休克蛋白)相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。與菌絲形成相關(guān)的基因，尤其是受到RAS/cAMP通路調(diào)節(jié)的有關(guān)基因，包括ECE1、ALS3、HWP1、HGC1和RAS1等，表達(dá)均發(fā)生下調(diào)[22]，加入外源性的cAMP能夠恢復(fù)這種下調(diào)。同時，經(jīng)中央靜脈導(dǎo)管感染的大鼠模型實(shí)驗(yàn)表明，紫檀芪在體內(nèi)對白念珠菌生物被膜具有一定程度抑制作用活性也被證實(shí)。

3.7 漢防己甲素

研究表明，漢防己甲素對生物被膜的形成和維持具有明顯的干擾作用。這種作用主要與降低細(xì)胞表面疏水性，高濃度抑制白念珠菌生長，抑制酵母向菌絲的形態(tài)轉(zhuǎn)變有關(guān)。實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果顯示，在經(jīng)過漢防己甲素處理后，一些參與編碼菌絲形成的重要基因表達(dá)異常，而加入外源性的cAMP后，白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變能夠恢復(fù)，證實(shí)這種作用主要與RAS/cAMP通路有關(guān)。秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditiselegans)的白念珠菌感染模型實(shí)驗(yàn)表明，漢防己甲素具有一定體內(nèi)抗菌活性[23]。

4 問題與展望

抗真菌感染的防治面臨著巨大的挑戰(zhàn)，理解和掌握白念珠菌致病和耐藥機(jī)制，開發(fā)具有殺菌作用的藥物，對新型抗真菌藥物的研究至關(guān)重要。白念珠菌的致病因子如黏附素、侵襲素、菌絲特異基因、水解酶、熱休克蛋白、液泡相關(guān)蛋白等，是理想的抗真菌藥物靶點(diǎn)。通過干擾白念珠菌的致病因素，并提高宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫，是今后抗真菌研究領(lǐng)域的趨勢。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

上海市自然科學(xué)基金 (17ZR1437700)；國家自然科學(xué)基金 (81470158)

陳鍇，男 (漢族)，本科在讀.E-mail:515854039@qq.com

閻瀾,E-mail:ylan20001228@sina.com

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1673-3827(2017)12-0180-04

2017-03-20