曾慧

(四川成都崇州市人民醫(yī)院，四川 成都 611230)

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·論 著·

胎盤中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平對(duì)膽汁酸排泌的影響

曾慧

(四川成都崇州市人民醫(yī)院，四川 成都 611230)

目的:探討胎盤中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因FIC1、MDR3和BSEP表達(dá)量對(duì)妊娠期膽汁酸排泌功能及胎兒預(yù)后的影響。方法：采用RT- PCR、免疫印跡、免疫組化等檢測(cè)手段檢測(cè)我院妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)患者(ICP組，38例)及正常妊娠孕婦(對(duì)照組，38例)胎盤組織中FIC1、MDR3和BSEP mRNA水平及MDR3和BSEP蛋白表達(dá)情況，并對(duì)兩組孕婦丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、甘氨膽酸表達(dá)量及新生兒圍生期各指標(biāo)進(jìn)行比較。結(jié)果：FIC1、MDR3基因mRNA及MDR3蛋白在ICP組中均為弱表達(dá)，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而BSEP mRNA及蛋白表達(dá)量在兩組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；此外，ICP組丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、甘氨膽酸、羊水糞染率均高于對(duì)照組(P<0.05)，而孕周、胎兒體重、Apgar評(píng)分均低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：FIC1、MDR3基因表達(dá)下調(diào)可對(duì)胎盤膽汁酸排泌起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，從而影響胎兒圍生期預(yù)后情況。

膽汁淤積癥； 妊娠； 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白； 胎兒； 胎盤

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一種以瘙癢及黃疸為主要特征的妊娠期特有并發(fā)癥，且多發(fā)于妊娠中、晚期[1]。目前研究顯示，ICP雖不會(huì)對(duì)母體造成嚴(yán)重危害，但?？芍绿壕狡?、早產(chǎn)、畸胎、低體重兒或死胎等現(xiàn)象發(fā)生，從而顯著增加圍產(chǎn)兒患病率及死亡率[2]。因此，早期診斷及針對(duì)性治療具有一定臨床意義。而轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)變異則是導(dǎo)致肝膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)功能異常的重要因素之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因FIC1(ATP8B1)、MDR3(ABCB4)、BSEP(ABCB11)表達(dá)異常均與母體肝臟膽汁酸排泌及淤積具有一定相關(guān)性，但針對(duì)以上3個(gè)基因在胎盤組織中表達(dá)情況的報(bào)道較少[3- 4]。鑒于ICP的發(fā)生對(duì)胎兒危重程度明顯高于母體，因此有必要就3個(gè)基因在胎盤中的表達(dá)情況進(jìn)行深入研究，以便進(jìn)一步揭示ICP的發(fā)病機(jī)制。本研究從胎盤組織及胎兒角度，通過實(shí)時(shí)定量PCR及免疫印跡等方法研究上述基因表達(dá)對(duì)膽汁排泌及胎兒預(yù)后的影響，現(xiàn)將結(jié)果呈報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年2月至2015年1月由我院產(chǎn)科收治且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的ICP患者共計(jì)38例作為ICP組，患者年齡24～35歲，平均(27.5±3.4)歲，平均孕周(36.1±2.32)周；此外，隨機(jī)抽選38例同期正常妊娠女性作為對(duì)照組，年齡23～36歲，平均(27.4±3.5歲)，平均孕周(38.3±2.73)，在各項(xiàng)指標(biāo)符合剖宮產(chǎn)手術(shù)情況下自愿采取擇期剖宮產(chǎn)手術(shù)。ICP患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) ICP確診參考文獻(xiàn)[5]所述；(2) 單胎，擇日剖宮產(chǎn)；(3) 既往無高血壓、糖尿病及肝、腎相關(guān)疾病史；(4) 未合并其他妊娠相關(guān)疾病；(5) 胎兒無畸形；(6) 無感染性疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

RNA提取試劑盒購(gòu)自TAKARA公司，MDR3一抗、BSEP一抗及生物素標(biāo)記二抗及內(nèi)參β- actin購(gòu)自abcam公司，福爾馬林、TBST、石蠟等HE染色試劑購(gòu)自杭州博日生物科技有限公司，丙氨酸轉(zhuǎn)移酶及總膽紅素試劑盒購(gòu)自R&D公司，電泳儀購(gòu)自Bio- RID公司，RT- PCR儀購(gòu)自Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 兩組孕婦剖宮術(shù)畢10 min內(nèi)從母體面取1 cm×1 cm×1 cm胎盤組織塊，生理鹽水漂洗后分成兩份，1份放入10%福爾馬林固定，另1份放于-80 ℃保存。胎兒則進(jìn)行常規(guī)檢查，記錄其體重、身長(zhǎng)、胎盤重量并進(jìn)行新生兒Apgar評(píng)分。羊水糞染情況判斷：0°羊水清，無污染；Ⅰ°呈淡黃色，為輕度污染；Ⅱ°黃綠色，中度污染；Ⅲ°棕黃色黏稠，重度污染。羊水糞染率(%)=(1-無污染例數(shù)/總例數(shù))×100%。血樣收集：(1) 母體外周血，兩組患者均在實(shí)施剖宮術(shù)前空腹抽取靜脈血2管，1管進(jìn)行丙氨酸轉(zhuǎn)移酶及總膽紅素測(cè)定，另1管進(jìn)行甘氨膽酸測(cè)定；(2) 臍帶血，新生兒斷臍后收集臍帶血約2 ml，與母體外周血一并進(jìn)行甘氨膽酸測(cè)定。

1.3.2 RT- PCR 采取兩步法，采用Trizol抽提獲得組織總RNA后進(jìn)行RT- PCR，將其以10倍稀釋度進(jìn)行稀釋后作為模板進(jìn)行定量PCR，反應(yīng)條件70 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，95 ℃ 4 min，4 ℃ 5 min，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。設(shè)計(jì)FIC1(ATP8B1)、MDR3(ABCB4)、BSEP(ABCB11)及GAPDH引物序列(表1)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)40次，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)cDNA量模板中原始濃度。

表1 引物及內(nèi)參設(shè)計(jì)

基因正義鏈(5'-3')反義鏈(5'-3')FIC1(ATP8B1)GATGTGGCTCGCCATAAAATGGAAGTGGAAAGAAATTCAAGTTGGMDR3(ABCB4)ATGCCAGTTCATTTGCTCCAGCTACGACCCCTTGGCGGBSEP(ABCB11)GAGAGGGTCGGACCTGCATGACACGACAGCAATGATATCTGAGTGAPDHCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC

1.3.3 免疫印跡 按蛋白提取試劑盒步驟獲取目的蛋白后，以β- actin為內(nèi)參進(jìn)行10% SDS- PAGE，上樣量為40 μg蛋白垂直電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，并添加5%脫脂牛奶進(jìn)行過夜封閉，TBST清洗3次后依據(jù)檢測(cè)蛋白不同分別加入相應(yīng)一抗MDR3(濃度1∶50，abcam公司,鼠抗人)、一抗FIC1(濃度1∶100，abcam公司，鼠抗人)、一抗BSEP(濃度1∶250，abcam公司，鼠抗人)進(jìn)行4 ℃過夜孵育，次日用TBST清洗3次后加入生物素標(biāo)記二抗(濃度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 500)(abcam公司，羊抗鼠)，37 ℃孵育1 h后加入顯影液。由Gel pro5.0軟件分析成像灰度值，并參考內(nèi)參β- actin灰度值比較目的蛋白水平。

1.3.4 免疫組化 將10%福爾馬林固定24 h后的組織進(jìn)行石蠟包埋、切片(4 μm)脫蠟處理，3%雙氧水室溫孵育30 min，PBS沖洗并浸泡5 min，并進(jìn)行抗原修復(fù)。采用10%牛血清過夜封閉，去除血清后依據(jù)蛋白不同分別加入鼠抗人MDR3(濃度1∶50)或鼠抗人BSEP(濃度1∶250)，過夜孵育，次日用TBST清洗3次后加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min。TBST清洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37 ℃ 20 min，TBST清洗3次，加入顯色劑(DAB)。水洗，復(fù)染，中性樹脂封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料及胎兒情況比較

兩組孕婦年齡、孕次差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而孕周、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、胎盤重量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；同時(shí)，兩組胎兒體重、Apgar評(píng)分及羊水糞染率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

組別年齡/歲孕周/周孕次/次丙氨酸轉(zhuǎn)移酶/U·L-1總膽紅素/μmol·L-1對(duì)照組27.4±3.538.3±2.731.23±0.3123.51±13.444.95±2.64ICP組27.5±3.436.1±2.321.21±0.34162.46±67.9220.42±5.83t/χ2值0.1263.7850.26812.37114.934P值>0.05<0.01>0.05<0.01<0.01組別新生兒體重/kgApgar評(píng)分/分胎盤重量/g羊水糞染率/%對(duì)照組3.64±0.339.38±0.63639.1±38.27.9ICP組2.98±0.428.14±0.89613.8±27.552.6t/χ2值6.9927.5464.59418.024P值<0.01<0.01<0.05<0.01

2.2 兩組外周血及臍帶血甘氨膽酸分析

對(duì)照組孕婦外周血甘氨膽酸含量(2.81±1.23) mg·L-1，低于ICP組孕婦[(27.5±12.3) mg·L-1]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.343，P<0.01)；對(duì)照組臍帶血甘氨膽酸含量(5.54±1.73) mg·L-1，低于ICP組[(19.94±7.34) mg·L-1]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.324，P<0.01)。

2.3 兩組FIC1、MDR3、BSEP基因mRNA表達(dá)水平

ICP組的FIC1、MDR3基因mRNA為弱表達(dá)，且表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；兩組BSEP基因mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 兩組間FIC1、MDR3、BSEP基因mRNA表達(dá)水平比較

2.4 免疫印跡

兩組在140 kDa(MDR3)、160 kDa(BSEP)、34 kDa(FIC1)均可見明顯條帶，其中對(duì)照組在140 kDa及34 kDa條帶處顏色明顯深于ICP組，經(jīng)灰度分析可知，兩者差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，兩組160 kDa條帶顏色相近，灰度分析下兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

1、2泳道為對(duì)照組，3、4泳道為ICP組

圖2 蛋白質(zhì)免疫印跡

2.5 免疫組化結(jié)果

MDR3蛋白和BESP蛋白在對(duì)照組與ICP組中定位及分布無明顯差異，均勻分布于具有微絨毛的滋養(yǎng)層細(xì)胞膜上，但兩組蛋白在對(duì)照組中呈現(xiàn)顏色較ICP組深，見圖3。

3 討 論

ICP是臨床妊娠晚期較常見的一種肝臟功能損傷性疾病，其臨床表現(xiàn)為黃疸、皮膚瘙癢等癥狀，且常伴隨部分肝功能生化指標(biāo)，如丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、甘氨膽酸等輕中度升高。目前，ICP全球發(fā)病率約0.8%～12%[6]，而我國(guó)上海、四川等地是該病高發(fā)區(qū)域之一。由于ICP可對(duì)胎兒預(yù)后造成多種不良影響，因此，早期診斷及干預(yù)顯得尤為重要，而母胎間膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)異常及膽汁酸毒性作為該病的直接原因，或許可為進(jìn)一步研究該病發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

A.對(duì)照組胎盤組織中MDR3蛋白表達(dá); B.ICP組胎盤中MDR3蛋白表達(dá); C.對(duì)照組胎盤組織中BSEP蛋白表達(dá)； D.ICP組胎盤中BSEP蛋白表達(dá)

圖3 不同蛋白在胎盤中表達(dá)情況 ×400

3.1 膽汁酸的作用機(jī)制及其對(duì)胎兒預(yù)后的影響

研究顯示，妊娠中晚期時(shí)，由于胎兒及母體膽汁酸濃度差的存在，使得胎兒產(chǎn)生的膽汁酸可經(jīng)胎盤ATP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及ATP非依賴的膽汁酸排泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至母體，并最終排泄出體外[7]。然而，當(dāng)ICP發(fā)生時(shí)，母體出現(xiàn)膽汁酸代謝異常及膽汁酸淤積，使得胎盤兩側(cè)膽汁酸濃度差消失，甚至逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而造成胎兒體內(nèi)膽汁酸淤積。而本研究證實(shí)，ICP患者其母體外周血及臍帶血中甘氨膽酸含量均顯著高于對(duì)照組，與之前報(bào)道[8]相符合。而從孕周、胎兒體重、Apgar評(píng)分、羊水糞染率可知，ICP組胎兒預(yù)后較對(duì)照組差。研究顯示，妊娠晚期孕周差異對(duì)胎兒體重影響較大，而對(duì)于Apgar評(píng)分及胎兒預(yù)后的影響較小[9]，本研究主要觀察母體中3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)膽汁酸排泌的影響，因此孕周差異并未對(duì)本研究造成影響。膽汁酸作為胎糞的重要成分之一，其含量的增加必然會(huì)導(dǎo)致發(fā)生羊水糞染幾率增加[10]。此外，高濃度膽汁酸還可引起線粒體膜的破壞，生成氧自由基，減少胎兒對(duì)氧的利用度，引發(fā)胎兒窘迫等癥狀發(fā)生。而胎兒窘迫發(fā)生時(shí)，機(jī)體血流將主要供應(yīng)心、腦、腎等重要臟器，腸道等次要部位血流減少，肛門括約肌松弛并排出大量胎糞，加劇羊水污染，進(jìn)而形成惡性循環(huán)[11]。由此可知，ICP患者膽汁酸淤積是造成胎兒預(yù)后不良的重要誘因。然而，鑒于胎盤存在多種膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，因此通過分子水平的研究將有助于我們進(jìn)一步確認(rèn)其致病機(jī)制，并探索更有效的治療措施。

3.2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)膽汁酸排泌的影響

近年來，通過對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IC1、MDR3、BSEP可能與膽汁酸排泌具有一定相關(guān)性。這3類蛋白主要分布于毛細(xì)膽管膜中，其中FIC1是一種P型ATP酶，具有氨基磷脂或磷脂載體內(nèi)向轉(zhuǎn)移酶的作用，并有利于維持毛細(xì)膽管膜脂質(zhì)不對(duì)稱分布[12]。MDR3是磷脂載體，具有轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂及排泌毒性藥物作用[13]。BSEP蛋白是膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體。而本研究證實(shí)，ICP組MDR3、FIC1基因mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，且MDR3蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組。以往研究[14]發(fā)現(xiàn)，MDR3基因突變會(huì)導(dǎo)致患者肝臟組織中蛋白量減少，從而引起膽汁中磷脂水平下降，游離膽汁酸增多，加重肝細(xì)胞損傷。而胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞與肝細(xì)胞具有相似結(jié)構(gòu)，且具有相應(yīng)的載體蛋白，因此低水平MDR3可能導(dǎo)致胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞同樣受到膽汁酸損傷，從而無法起到有效傳遞物質(zhì)及排毒作用。而對(duì)于FIC1蛋白，研究[15]發(fā)現(xiàn)，其蛋白含量減少將會(huì)引起胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低，進(jìn)而影響ATP依賴膽汁酸載體含量。正如前人研究[16]所知：高膽汁酸環(huán)境中，胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中可參與物質(zhì)交換的微絨毛數(shù)量減少或功能減弱，甚至還可出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂、溶解等現(xiàn)象，從而對(duì)各種載體蛋白功能產(chǎn)生影響。此外，作為肝臟中主要膽汁酸載體蛋白，BSEP蛋白在胎盤組織中的作用則并不顯著，正如本研究所示，ICP組及對(duì)照組的BSEP mRNA水平及蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而當(dāng)母兒血液中膽汁酸水平均增高情況下，BSEP仍處于低表達(dá)，其進(jìn)一步提示，胎盤中膽汁酸可能未涉及BSEP蛋白，且胎盤中可能存在其他轉(zhuǎn)運(yùn)載體。因此，對(duì)于妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，研究3種可影響膽汁酸代謝的基因在ICP胎盤中的表達(dá)情況，將有助于我們進(jìn)一步了解影響膽汁酸排泌的相關(guān)因素，也有利于提高ICP不良妊娠結(jié)局的診斷，為疾病治療提供新的思路。

[1] 陳友英，陳宣伊，梁國(guó)強(qiáng).茵陳加味湯聯(lián)合熊去氧膽酸治療妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥62例[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，33(2):159- 161．

[2] 賀晶，陳璐，梁琤.妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生死胎的臨床因素分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2011，46(5):333- 337．

[3] DAVIT- SPRAUL A，GONZALES E，JACQUEMIN E.NR1H4 analysis in patients with progressive familial intrahepatic cholestasis，drug- induced cholestasis or intrahepatic cholestasis of pregnancy unrelated to ATP8B1，ABCB11 and ABCB4 mutations[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol，2012，36(6):569- 573．

[4] ABU- HAYYEH S，PAPACLEOVOULOU G，L?VGREN- SANDBLOM A，et al.Intrahepatic cholestasis of pregnancy levels of sulfated progesterone metabolites inhibit farnesoid X receptor resulting in a cholestatic phenotype[J].Hepatology，2013，57(2):716- 726．

[5] 賀晶，劉興會(huì)，漆洪波.2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥診療指南[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志:電子版，2013，5(7):34- 40．

[6] ANZIVINO C，ODOARDI M R，MESCHIARI E，et al.ABCB4 and ABCB11 mutations in intrahepatic cholestasis of pregnancy in an Italian population[J].Dig Liver Dis，2013，45(3):226- 232．

[7] 李常曉，王朝霞.嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積易感基因的研究進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志，2011，27(7):694- 699.

[8] 張雅琴，沈玲瓏.餐后2小時(shí)血清甘膽酸測(cè)定對(duì)妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的早期診斷意義[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2015，13(4):636- 637．

[9] 傅江行，方海婭.妊娠合并甲狀腺功能減低對(duì)妊娠結(jié)局及胎兒的影響研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24(8):98- 100．

[10] 張麗娟，張鳳華，湯麗麗，等.妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥與胎兒損傷[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，38(6):645- 652．

[11] 陳麗莎，陳縈晅.膽汁淤積的發(fā)病機(jī)制和診治現(xiàn)狀[J].胃腸病學(xué)，2012，17(7):385- 388．

[12] GEENES V，L?VGREN- SANDBLOM A，BENTHIN L，et al.The reversed feto- maternal bile acid gradient in intrahepatic cholestasis of pregnancy is corrected by ursodeoxycholic acid[J].PloS One，2014，9(1):e83828．

[13] YANG X F，LIU G S，LI M X.Analysis of mutations of MDR3 exons 9 and 23 in infants with parenteral nutrition- associated cholestasis[J].Exp Ther Med，2015，10(6):2361- 2365．

[14] 陳新萍，張智，劉絲蓀.胎盤ABCB4表達(dá)下調(diào)對(duì)膽汁酸排泌功能的負(fù)性調(diào)節(jié)作用及其對(duì)圍生兒預(yù)后的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2011，27(5):1012- 1015．

[15] GEENES V，WILLIAMSON C.Liver disease in pregnancy[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2015，29(5):612- 624．

[16] 舒賽男，駱冉.進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥診治及研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2013，28(4):300- 304．

2016- 03- 25

2016- 07- 19

曾慧(1979-)，女，四川崇州人，主治醫(yī)師。E- mail:2893648540@qq.com

曾慧.胎盤中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平對(duì)膽汁酸排泌的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(6)：913- 917.

R714.225

A

1671- 6264(2016)06- 0913- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.017