黃聰琳，郭敏，王曉琳，姜華

甘肅省中醫(yī)院，甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050

應(yīng)用ITS2條形碼鑒定藏藥鐮形棘豆

黃聰琳，郭敏，王曉琳，姜華

甘肅省中醫(yī)院，甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050

目的對(duì)藏藥鐮形棘豆及其易混偽品進(jìn)行分子鑒定，以確保該藥材的質(zhì)量及臨床療效。方法提取樣本基因組DNA，對(duì)核基因ITS2片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，并對(duì)所得序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，并構(gòu)建基于ITS2序列的鄰接（NJ）樹(shù)。結(jié)果鐮形棘豆物種種內(nèi)K2P遺傳距離為0，與其他混偽品的K2P遺傳距離分布于0.068～0.084，構(gòu)建的NJ樹(shù)表明ITS2序列能夠區(qū)分鐮形棘豆與其他易混偽品。結(jié)論ITS2序列作為DNA條形碼可以方便快捷地鑒別鐮形棘豆及其易混偽品，為其種質(zhì)資源鑒定及臨床安全用藥提供了重要分子依據(jù)。

鐮形棘豆；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定

鐮形棘豆Oxytropis falcate Bunge是我國(guó)青藏高原常用的民間草藥之一，收載于1995年頒布的《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥第一冊(cè)。全草入藥，具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈生血、通利大便等功效[1]。由于其突出的抗炎療效，被譽(yù)為藏醫(yī)“三大抗炎藥”之一，是奇正消痛貼膏、青鵬膏劑、流感丸、藏紅花油、棘豆扶正膠囊等多種藏藥復(fù)方或成藥的主要藥物。王棟等[2]實(shí)驗(yàn)研究顯示，鐮形棘豆具有良好的外周鎮(zhèn)痛活性，對(duì)急性炎癥和慢性炎癥都有較好的作用。其黃酮類(lèi)成分具有抗炎與抗氧化活性[3]。有研究報(bào)道，鐮形棘豆活性成分對(duì)胃癌、肝癌細(xì)胞株具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性[4-5]。鐮形棘豆對(duì)中波紫外線(xiàn)照射所致人角質(zhì)形成細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[6]。戴衍朋等[7]以小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆具有較好的止血、促凝血作用。

但至目前為止，對(duì)藏藥鐮形棘豆生藥鑒定方面的研究還非常薄弱，并且只見(jiàn)于利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定[8]。棘豆屬近緣種植物，尤其是同生境分布的近緣種，產(chǎn)地來(lái)源相同、表型具有趨同性、形態(tài)特征相似，往往很難通過(guò)傳統(tǒng)的基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定等方法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。因此，本研究提出采用DNA條形碼（DNA barcoding）的方法對(duì)鐮形棘豆及其易混偽品砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等進(jìn)行分子鑒定。

DNA條形碼技術(shù)利用短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列片段對(duì)物種進(jìn)行分子鑒定[9]。因其是基于物種基因的檢測(cè)，而不是與環(huán)境密切相關(guān)的表現(xiàn)型，避免了人為因素和客觀(guān)條件的影響，為生藥鑒定提供了本質(zhì)依據(jù)，適用于對(duì)中藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b定[10]。ITS2序列位于5.8S和28S rRNA之間，在物種水平的變異較快，已被用于多個(gè)物種的DNA條形碼鑒定[11-13]。本研究利用ITS2條形碼對(duì)鐮形棘豆及其易混偽品進(jìn)行比較研究，旨在為該藥材的質(zhì)量控制、臨床安全用藥及合理開(kāi)發(fā)利用提供分子依據(jù)。

1 儀器與試藥

共20個(gè)樣本，來(lái)自7個(gè)物種，包括樣品及Genbank下載序列。樣品由蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授盛紅梅進(jìn)行鑒定，憑證標(biāo)本保存于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所。樣品及GenBank下載序列見(jiàn)表1。

低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），恒溫水浴鍋（科哲，中國(guó)上海），PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)），水平電泳儀（Bio-Rad，美國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）。

植物DNA提取試劑盒、dNTP Mix、PCR buffer（10×）、Taq酶，北京天根生物技術(shù)有限公司；定量Marker DS2000，廣東東盛生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 研究材料信息

2 方法

2.1 樣品總DNA提取

稱(chēng)取100 mg樣品組織，在預(yù)冷的研缽中進(jìn)行快速充分研磨，然后利用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 目的序列PCR擴(kuò)增

ITS2序列擴(kuò)增引物正向5'-GCGATACTTGGTGTG AAT-3'，反向5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反應(yīng)體系25 μL，包括：DNA模板0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由上海生工生物工程有限公司完成測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)，去除引物區(qū)，使用基于HMM的注釋方法[14]，去除兩端5.8s和28s區(qū)段，獲得ITS2間隔區(qū)序列。將所有序列用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA軟件分析比對(duì)，并基于K2P模型計(jì)算序列間進(jìn)化距離，用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)。利用自展Bootstrap檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各分支的支持率，1000次重復(fù)。

3 結(jié)果

3.1 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

采用ITS2序列引物對(duì)采集樣本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

Application of ITS2 Barcoding in Identification of Oxytropis Falcate Bunge

HUANG Cong-lin,GUO Min, WANG Xiao-lin, JIANG Hua
(Gansu Provincial Hospital of TCM, Gansu Academy of Chinese Medicine, Lanzhou 730050, China)

ObjectiveTo identify Oxytropis falcate Bunge from its adulterants; To secure the quality and clinical efficacy of Oxytropis falcate Bunge.MethodsGenomic DNA was extracted. ITS2 fragment of nuclear gene was amplified and sequenced. The homology of the sequences was analyzed, and the related data were analyzed by software MEGA. The NJ (neighbor-joining) tree was constructed based on ITS2 sequence.ResultsThe intraspecific genetic distance of Oxytropis falcate Bunge (K2P distance) was 0, and the interspecific genetic distance (K2P distance) between Oxytropis falcate Bunge and its adulterants ranged among 0.068-0.084. The constructed NJ tree showed that ITS2 could identify Oxytropis falcate Bunge from its adulterants correctly.ConclusionITS2 barcode can be used to identify Oxytropis falcate Bunge from its adulterants effectively, and this study provides important molecular evidence for the identification of Oxytropis falcate Bunge and safety in its clinical use.

Oxytropis falcate Bunge; DNA barcoding; ITS2; molecular identification

R282.5

A

1005-5304(2017)02-0076-03

甘肅省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題（GZK-2012-71）；甘肅省自然科學(xué)基金（1506RJZA143）；甘肅省中醫(yī)院博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)課題（博2013-9）

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.019