張秀麗，孟盼，向韻，雷昌，劉芳，黃丹，蔡川，蔡光先，王宇紅

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007；2.中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410007

補陽還五精簡方的體外篩選及體內(nèi)驗證研究

張秀麗1，2，孟盼1，2，向韻1，2，雷昌1，2，劉芳1，黃丹1，2，蔡川1，2，蔡光先1，2，王宇紅1，2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007；2.中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410007

目的篩選補陽還五精簡方的最佳配伍，并進行驗證。方法采用H2O2誘導(dǎo)建立PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型?？疾觳煌瑵舛?.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL補陽還五湯對體外氧化應(yīng)激模型細(xì)胞的保護作用，確定最佳作用濃度。采用正交試驗設(shè)計，將補陽還五湯各單味藥隨機配伍分成補陽還五湯不同拆方組及對照組（僅加細(xì)胞培養(yǎng)基）、正常組（無H2O2和藥物處理）、模型組,考察對PC12細(xì)胞的保護作用，篩選精簡方，確定精簡方各單味藥的配伍比例，MTT法測定各組細(xì)胞存活率。采用大腦中動脈線栓法復(fù)制局灶性腦缺血模型，SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、補陽還五湯組和精簡方高、中、低劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，驗證篩選結(jié)果。結(jié)果與其他拆方組比較，黃芪＋川芎＋地龍對PC12細(xì)胞的保護作用最佳（P＜0.05），且與補陽還五湯原方相當(dāng)；與模型組比較，補陽還五湯組及精簡方各劑量組均能改善模型大鼠大腦皮層梗死面積、降低腦組織水腫程度（P＜0.05），且以精簡方中劑量組最佳。結(jié)論補陽還五精簡方最佳配伍為黃芪、川芎、地龍，其比例為10∶3∶1。

補陽還五湯；拆方；局灶性腦缺血模型；氧化應(yīng)激模型；大鼠

中國腦卒中防治報告（2015）提示，腦卒中作為我國第1位死亡原因，其造成的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)每年高達400億元[1]。因此，如何有效防治腦卒中已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究和臨床工作急需解決的難題和重要任務(wù)。臨床應(yīng)用補陽還五湯治療缺血性中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥療效較好。但其藥味眾多，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)難以明確。本實驗采用H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，結(jié)合正交試驗設(shè)計對補陽還五湯進行體外拆方研究，篩選最佳精簡方，并采用永久性局灶性腦缺血（MCAO）模型，對篩選結(jié)果進行體內(nèi)驗證。

1 實驗材料

1.1 藥物及制備

補陽還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g，地龍3 g）和各單味藥及篩選獲得的精簡方干浸膏均由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥所提供。補陽還五湯和精簡方干浸膏分別相當(dāng)于原藥材4.5、4.7 g/g。所有藥物均采用無菌水溶解，配制成一定濃度的母液，0.25 μm濾膜過濾除菌，使用時無菌PBS稀釋至所需濃度。

1.2 細(xì)胞和動物

PC12細(xì)胞系（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞），高分化，長沙贏潤生物技術(shù)有限公司。SPF級10周齡SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量250～280 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于室溫（20±1）℃，濕度60％～70％，自由飲水進食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進入實驗狀態(tài)。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone），胎牛血清（FBS，GIBCO），D-Hanks（Solarbio），胰蛋白酶（Solarbio），MTT（Sigma）。臺式低溫高速離心機（Eppendorf），超純水分離系統(tǒng)（ELGA），超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司），倒置顯微鏡（ZEISS)，CO2培養(yǎng)箱（NEW BRUN-SWICK），多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scien Tific）。

2 實驗方法

2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及體外氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立

（九）提高仔豬的初生重 仔豬的初生重與存活率、哺育率和斷奶重密切相關(guān)，初生重大，存活率、哺育率高、斷奶體重亦大，初生重1.3～1.5 kg與1.0 kg相比，前者斷奶重提高2.5 kg。提高仔豬初生重應(yīng)重視種豬的選擇，加強妊娠母豬的飼養(yǎng)管理（前文已述及）。由于繁殖性狀的遺傳力低，可采用不同品種或品系間的雜交，以提高仔豬的初生重和生活力。

參照文獻[2]方法。將PC12細(xì)胞接種于TC處理的培養(yǎng)瓶，采用含10％胎牛血清DEME高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。37 ℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，待細(xì)胞貼壁融合至90％時，0.25％胰蛋白酶消化，以1×104個/孔接種于96孔板，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，替換為無血清培基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再用H2O2終濃度為0.3 mmol/L無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

2.2 補陽還五湯拆方分組原則及對PC12模型細(xì)胞保護作用的考察

采用正交試驗設(shè)計，將補陽還五湯7個單味藥隨機配伍分成補陽還五全方組、黃芪＋當(dāng)歸＋赤芍＋川芎＋紅花組、黃芪＋當(dāng)歸＋桃仁＋地龍組、黃芪＋赤芍＋桃仁組、黃芪＋川芎＋地龍組、黃芪＋紅花組、當(dāng)歸＋紅花＋桃仁組、當(dāng)歸＋川芎組、當(dāng)歸＋赤芍＋地龍組、川芎＋紅花＋桃仁＋地龍組、赤芍＋紅花＋地龍組、赤芍＋川芎＋桃仁組。補陽還五湯原方考察濃度均為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL，不同拆方中單味藥濃度按照補陽還五湯原方中單味藥比例進行確定。將細(xì)胞與藥物共同作用2 h，再加入H2O2繼續(xù)培育2 h。另設(shè)對照組（僅加細(xì)胞培養(yǎng)基）、正常組（無H2O2和藥物處理）、模型組（僅加H2O2處理）。MTT法測定細(xì)胞存活率[（OD值處理組―OD值空白對照組）÷（OD值正常組―OD值空白對照組）×100％]。

2.3 體內(nèi)動物模型制備、分組、給藥及指標(biāo)測定

采用大腦中動脈線栓法復(fù)制MCAO大鼠模型[3]。按體質(zhì)量將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、補陽還五湯組和精簡方高、中、低劑量組，每組10只。術(shù)后第1日開始給藥，補陽還五湯組給予補陽還五湯（相當(dāng)于干浸膏3.15 g/kg），精簡方各劑量組給予低（干浸膏1.68 g/kg）、中（干浸膏2.41 g/kg）、高劑量（干浸膏3.44 g/kg）灌胃[4]。模型組和假手術(shù)組給予等量無菌蒸餾水。給藥體積均為0.05 mL/kg，每日1次。自由飲食、活動，連續(xù)給藥7 d后脫頸處死取材備用。

2.3.1 腦梗死面積比檢測 取大鼠腦組織-20 ℃冷凍20 min后去掉嗅球、小腦和腦干部分，取最大缺血斷面，即漏斗柄部位及后葉尾極之間的腦組織。腦片37 ℃避光、2％紅四氮唑染色30 min，正常組織呈深紅色，梗死組織則為白色。斷面拍照采用圖像分析系統(tǒng)進行掃描，計算腦梗死面積。腦梗死面積（％）＝（健側(cè)總面積－患側(cè)非梗死區(qū)面積）÷2×健側(cè)總面積×100％。

2.3.2 腦干濕重比檢測 取大鼠腦組織，濾紙吸干其表面殘留血漬，置于小稱量瓶內(nèi)稱取濕重，再將稱量瓶放入恒溫干燥箱內(nèi)，105 ℃恒溫烤48～96 h至恒重（3次稱樣差別≤0.2 mg）。稱干重后，計算腦組織含水量。腦組織含水量（％）＝（濕重－干重）÷濕重×100％。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 不同濃度補陽還五湯原方對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞保護作用的影響

圖1 補陽還五湯對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞的影響（—x±s，n＝5）

4.2 補陽還五湯不同拆方對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞保護作用的影響

將10 mg補陽還五湯溶于10 mL PBS中，配制成1 mg/mL。按補陽還五湯原方配伍比例，確定10 mL拆方中黃芪為8.4 mg，當(dāng)歸為0.4 mg，赤芍為0.3 mg，川芎、紅花、桃仁、地龍均為0.2 mg。MTT法觀察不同配伍對PC12細(xì)胞的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補陽還五湯原方與黃芪＋川芎＋地龍的配伍對PC12細(xì)胞的保護作用最佳，見圖2。將結(jié)果進行正交直觀分析和方差分析，表明精簡方最佳配伍組合為黃芪＋川芎＋地龍，見表1、表2。

圖2 補陽還五湯不同拆方對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞的影響（±s，n＝5）

表1 補陽還五湯不同拆方對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞保護作用正交試驗直觀分析結(jié)果

表2 補陽還五湯不同拆方對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞保護作用的方差分析結(jié)果

4.3 精簡方各單味藥黃芪、川芎、地龍最佳配伍比例的確定

4.3.1 各單味藥黃芪、川芎、地龍對模型細(xì)胞最佳保護作用濃度 根據(jù)補陽還五湯給藥后的實驗結(jié)果及預(yù)實驗摸索，我們設(shè)定單味藥黃芪考察濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL，川芎和地龍的考察濃度均為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

在較高濃度（0.5～4.0 mg/mL）范圍內(nèi)，黃芪濃度與模型細(xì)胞存活率呈正相關(guān)，對H2O2致?lián)p的PC12細(xì)胞發(fā)揮保護作用。由于2.0、4.0 mg/mL黃芪對模型細(xì)胞的保護作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義，從節(jié)約資源和減輕對細(xì)胞毒副作用的角度，確定黃芪最佳給藥劑量為2.0 mg/mL。川芎和地龍則相反，在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率明顯高于模型組，而更高濃度沒有保護作用，甚至產(chǎn)生毒副作用。見圖3。因此，川芎和地龍的最佳劑量均為0.2 mg/mL。

圖3 不同濃度單味藥對氧化應(yīng)激損傷模型細(xì)胞的影響（±s，n＝5）

4.3.2 黃芪、川芎、地龍不同配伍對模型細(xì)胞的保護作用 分別配制2.0 mg/mL黃芪、0.2 mg/mL川芎和0.2 mg/mL地龍，結(jié)合中醫(yī)臨床實踐和正交試驗結(jié)果，按黃芪∶川芎＝10∶3、黃芪∶地龍＝10∶1、川芎∶地龍＝3∶1比例進行給藥，結(jié)果見圖4。最佳作用濃度的黃芪、川芎、地龍不同配伍組均能對模型細(xì)胞發(fā)揮保護作用，精簡方最佳配伍比例為黃芪∶川芎∶地龍＝10∶3∶1。

圖4 最佳作用濃度黃芪、川芎和地龍不同配伍對模型細(xì)胞的影響（—x±s，n＝5）

4.3.3 精簡方最佳作用濃度及其與PC12細(xì)胞的生物相容性 按黃芪∶川芎∶地龍＝10∶3∶1比例配制精簡方，考察0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL精簡方和補陽還五湯對H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護作用，見圖5。在1 mg/mL范圍內(nèi)，精簡方能有效防止H2O2過氧化作用（P＜0.05），當(dāng)藥物濃度＞1 mg/mL時，則對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒副作用。與補陽還五湯組比較，同一濃度的精簡方能更好地發(fā)揮藥效。

圖5 精簡方和補陽還五湯對體外氧化應(yīng)激模型細(xì)胞的影響（±s，n＝5）

根據(jù)上述實驗結(jié)果，設(shè)精簡方和補陽還五湯與PC12細(xì)胞生物相容性研究的濃度均為1.0 mg/mL，與PC12細(xì)胞作用時間為1、2、4、6、16、24 h，見圖6。精簡方組在24 h內(nèi)能促進細(xì)胞增殖，與PC12細(xì)胞的生物相容性好；從曲線變化趨勢預(yù)測，甚至有可能在24 h后同樣發(fā)揮藥效作用，這有待于進一步研究。

圖6 精簡方及補陽還五湯與PCl2細(xì)胞的生物相容性（±s，n＝5）

4.4 精簡方對模型大鼠腦梗死面積比的影響

按照預(yù)實驗結(jié)果，精簡方各劑量組分別給予低、中、高劑量灌胃，結(jié)果術(shù)后7 d，除假手術(shù)組外，模型組、補陽還五湯組和精簡方高、中、低劑量組大腦左側(cè)皮層部位均有梗死灶。模型組大鼠腦梗死面積比均值高達20.85％，精簡方和補陽還五湯的藥物干預(yù)均能顯著減小腦梗死灶面積比（P＜0.05），精簡方中、低劑量組優(yōu)于高劑量組（P＜0.05），但與補陽還五湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），精簡方中、低劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但從紅四氮唑比值分布圖提示精簡方中劑量比低劑量樣品的集中程度更好，療效更優(yōu)。因此，實驗結(jié)果表明中劑量組療效最佳。結(jié)果見表3、圖7。

表3 各組大鼠腦梗死面積比比較（±s）

表3 各組大鼠腦梗死面積比比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別 只數(shù) 劑量/（g/kg） 腦梗死面積比/％ 變異系數(shù)假手術(shù)組 5模型組 5 20.85±2.31 0.11補陽還五湯組 5 3.15 8.34±0.80*0.09精簡方高劑量組 5 3.44 14.88±9.59 0.65精簡方中劑量組 5 2.41 7.06±1.53*0.22精簡方低劑量組 5 1.68 7.28±2.85*0.39

圖7 各組大鼠腦梗死面積觀察結(jié)果（紅四氮唑染色，×40）

4.5 精簡方對模型大鼠腦組織含水量的影響

腦缺血后，模型組腦含水量明顯增加。治療7 d后，精簡方中、低劑量組和補陽還五湯組腦含水量顯著減少，與模型相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；精簡方中、低劑量組之間及二者與補陽還五湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示精簡方中、低劑量和補陽還五湯均能減低腦組織的水腫程度，且精簡方中劑量效果最佳。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠腦組織含水量比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織含水量比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別 只數(shù)劑量/（g/kg） 腦組織含水量/％ 變異系數(shù)假手術(shù)組 5 78.43±0.71 0.04模型組 5 81.54±1.10 0.06補陽還五湯組 5 3.15 79.81±0.85*0.03精簡方高劑量組5 3.44 81.66±2.91 0.08精簡方中劑量組5 2.41 79.48±1.24*0.11精簡方低劑量組5 1.68 80.25±1.51*0.16

5 討論

補陽還五湯系清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立的治療半身不遂辨證屬氣虛血瘀證的經(jīng)典名方。本課題組前期大量研究表明，補陽還五湯能通過降低炎癥反應(yīng)、促進神經(jīng)干細(xì)胞增殖、調(diào)控caveolin-1、Toll樣受體等多種途徑有效防治腦缺血損傷[5-12]。但因其藥味眾多，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)難以闡明，不能完全滿足國際市場的標(biāo)準(zhǔn)，阻礙了其在國際市場上廣泛流通。

補陽還五湯重用生黃芪，大補元氣，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。配以當(dāng)歸尾活血和血，且有化瘀不傷血之妙，是為臣藥。川芎、赤芍、桃仁、紅花助當(dāng)歸尾活血祛瘀，地龍長于行散走竄、通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。各藥合用，使氣足以推動血行，瘀去絡(luò)通，則筋肉得養(yǎng)，痿廢可愈。本實驗運用反向藥理學(xué)方法，通過正交試驗研究了補陽還五湯及其不同拆方對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯原方與黃芪＋川芎＋地龍的配伍對PC12細(xì)胞的保護作用最好，正交直觀分析和方差分析亦顯示最佳配伍組合為黃芪＋川芎＋地龍，為精簡方的方藥配伍提供了實驗依據(jù)。

本研究考察了黃芪、川芎、地龍各單味藥對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的保護作用，確定黃芪的最佳給藥劑量為2.0 mg/mL，川芎和地龍最佳作用劑量為0.2 mg/mL，驗證了中藥配伍中“重用君藥”的理論。黃芪、川芎、地龍兩兩配伍研究表明，最佳作用濃度的黃芪、川芎、地龍不同配伍組均能對模型細(xì)胞發(fā)揮保護作用；精簡方最佳配伍比例為黃芪∶川芎∶地龍＝10∶3∶1。對PC12細(xì)胞的生物相容性的考察發(fā)現(xiàn)，精簡方組在24 h內(nèi)細(xì)胞存活率遠(yuǎn)高于100％，與PC12細(xì)胞的生物相容性非常好，為其臨床用藥的安全性提供了數(shù)據(jù)支持。

以MCAO模型大鼠為研究載體的體內(nèi)實驗表明，補陽還五湯和精簡方中劑量改善模型大鼠大腦皮層梗死面積、降低腦組織水腫程度的作用最佳，且二者療效相當(dāng)，進一步驗證了篩方結(jié)果。以上結(jié)果為進一步明確精簡方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與其藥物作用分子機制奠定了基礎(chǔ)。

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Study on in Vitro Screening and in Vivo Validation of Optimized Buyang Huanwu Decoction

ZHANG Xiu-li1,2, MENG Pan1,2, XIANG Yun1,2, LEI Chang1,2, LIU Fang1, HUANG Dan1,2, CAI Chuan1,2, CAI Guang-xian1,2, WANG Yu-hong1,2
(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 2. State Key Laboratory Training Bases of Powder and Innovative Drugs, Changsha 410007, China)

ObjectiveTo screen the optimized Buyang Huanwu Decoction (BYHWD); To verify it.MethodsH2O2was used to induce PC12 cell oxidative stress models. MTT method was used to determine the prevention effects of BYHWD at different concentrations (0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.5 mg/mL) on in vitro oxidative stress cell models to define the optimized concentration. Orthogonal design was used to divide BYHWD single medicine into decomposed BYHWD groups, control group (only with DMEM), normal group (without H2O2and medicine processing), and model group, to investigate the protective effects on PC12 cells. Optimized BYHWD was screened to decide the compatibility ratio of each medicine. MTT was used to detect the cell survival rate in each group. Middle cerebral artery occlusion was used to replicate MACO rat models. SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group, BYHWD group and optimized BYHWD high-, medium- and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. The screened results were verified.ResultsCompared with other decomposed BYHWD groups, the protective effects of the compatibility of Astragali Radix + Chuanxiong Rhizoma + Pheretima on PC12 cells was the best (P＜0.05), which was nearly equaled to BYHWD. Compared with the model group, BYHWD and the optimized one could evidently reduce cerebral cortex infarction area and improve the impaired brain edema (P＜0.05), and the medium-dose group was the best.ConclusionThe optimized BYHWD ratio is: Astragali Radix:Chuanxiong Rhizoma:Pheretima=10:3:1.

Buyang Huanwu Decoction; decomposed recipe; MCAO model; oxidative stress cell model; rats

R285.5

A

1005-5304(2017)02-0049-06

2016-04-12）

（

2016-05-12；編輯：華強）

國家自然科學(xué)基金青年基金（81403387）；湖南省教育廳一般項目（14C0862）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（2014135）；中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地開放基金重點項目（2015年）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動基金（自科）（9982-1001-015）

王宇紅，E-mail：wyh107@126.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.014