池曉峰

內蒙古赤峰市松山醫(yī)院，內蒙古赤峰024000

分子診斷技術在傳染病病原體檢測中的具體應用分析

池曉峰

內蒙古赤峰市松山醫(yī)院，內蒙古赤峰024000

傳染病能夠得到有效防控的條件和前提就是傳染病病原體的準確檢測，同時傳染病病原體的準確檢測也是科學給藥的基礎。但是，原有的病原體分離和培養(yǎng)等方法無法滿足防控疾病和臨床診療的需求。分析診斷技術在傳染病病原體檢測中的應用彌補了這方面的空白。該文對新一代的分子診斷技術在傳染病病原體檢測中的具體應用進行探討和分析，以期為此領域的廣大醫(yī)療工作者提供一些有價值的參考和依據。

高通量核苷酸測序；基因增擴；微點陣分析；分子診斷技術；傳染?。簧飩鞲屑夹g

傳染病是全世界范圍內的常見疾病和多發(fā)疾病，發(fā)病原因復雜、傳播速度極快。目前，我國乃至全世界的傳染病傳播呈現不斷擴大的上升趨勢，傳染病的變異和更新周期逐漸縮短，患者的癥狀逐漸加重，給患有傳染性疾病的全世界患者的健康帶來了極大的威脅，嚴重影響患者的生活質量和生命質量。傳染性疾病的爆發(fā)已經引起了全世界醫(yī)學專家的廣泛關注，已經成為了世界公共衛(wèi)生問題。傳染性疾病的病原體較多，傳統(tǒng)的檢測技術具有檢測時間長、檢測手段復雜、精確度較低等弊端，延長了傳染病病原體的檢測周期，極不利于傳染性疾病病原體的確診和治療。分子診斷技術的引進，對傳染病病原體檢測具有重要的應用價值和實踐意義，分子診斷技術采用先進的新一代測序技術和生物芯片技術，對傳染病病原體進行檢測，其具有確診時間短的優(yōu)勢。分子診斷技術在傳染病病原體檢測中的應用，將會是未來傳染病病原體檢測技術發(fā)展的趨勢。

1 新一代測序技術

1.1 病原體培養(yǎng)物樣本的基因組測序

對于病原體的確證方法，最精密、最準確的方法就是取得病原體的所有基因。通過核酸的提煉、文庫的建立和定量的質控，從感染病例當中分離出病原體，利用新一代的測序技術獲取病原體基因，進而對病原體進行精密而準確的認定，發(fā)現基因標志物用于檢驗試劑的研發(fā)，能夠有助于快速突破疾病的致病反應。病原體基因組還有另外一個作用，就是通過溯源分析以及耐藥分析，可以透徹深入分析疫情的傳播機制[1]。

1.2 非培養(yǎng)樣本病原體的檢測

非培養(yǎng)樣本病原體的檢測可以通過新一代的測序技術能夠實現。新一代的測序技術不想傳統(tǒng)技術需要對于病原體進行假設，相反，沒有對于病原體的預先假設，極為符合檢測非培養(yǎng)樣本病原體當中的“未知”病原體，這種檢測方法，能夠實現其他檢測手法無法達到的檢測目的，能夠解決其他方法無法解決的難題[2]。但是，非培養(yǎng)樣本病原體中，正常的菌群和宿主是其主要的核算背景，病原體的信噪比極低，因此，擁有極大的難度。原因在于病原體必須依靠優(yōu)秀的生物技術和領先的樣本處理手段，才能得以實現對于非培養(yǎng)樣本病原體的檢測，這種檢測手段的實施非常具有挑戰(zhàn)性。

2 生物芯片技術

生物芯片技術指的是利用微加工手段，建立微信系統(tǒng)在面積為一平方厘米的物體上，這個物體是一種固體或是液體的表面，利用特異性分子之間的作用的原理，進行分子自動檢測[3]。分子是核酸、蛋白質等，檢驗的屬性是快速的、精確的、平行的和高通量的。生物芯片包括蛋白質芯片、基因芯片以及芯片試驗室。當前，生物芯片技術產品已經廣泛引用于臨床試驗中，并且應用領域涉及到基因分型和耐藥監(jiān)測領域、微生物感染鑒別領域等。

2.1 病原微生物感染鑒別診斷

病原微生物種類繁多，在實際的臨床和實踐診治當中，對于病原微生物感染鑒別診斷具有巨大的需求[4]。生物芯片技術的優(yōu)點是高通量，能夠在同一時間對許多標志物進行監(jiān)測，對于各種病原體進行篩查，當前，多個此類產品已經面世。

2.2 病原微生物基因分型

疾病的生產和疾病預后的不同發(fā)展，是由于用一種類的病原微生物具有不同的基因型。所以，采用生物芯片技術針對核酸特異性序列進行基因分型非常有必要，這項基因分型技術具有重要的作用。比如利用生物芯片方法，HBV基因分型檢驗試驗盒，能夠劃分出8個基因型，應用血漿樣本以及血清樣本當中的HBV的檢驗[5]。雖然基因分型中的分子測序是黃金圭臬。在測序技術和基因芯片技術的比較當中，基因芯片技術優(yōu)點在于靈敏度極高，比如在針對一些微生物進行檢測時，由于含量非常低，利用原始標本檢測難度較大，因為難以滿足測序的基因要求，但是利用基因芯片技術就可以完成這種檢測，將信號擴大，能夠實現低拷貝模板檢測。

2.3 病原微生物耐藥檢測

基因芯片技術能夠檢測單核苷酸，還能夠檢測基因的特異性。目前，已經各種微生物耐藥檢測產品面世。比如TMDD變異檢測基因芯片試劑盒和HBV核酸，能夠在用一時間內，對HBV多聚酶進行分析，在檢測的2 000多份人類血液樣本中，測序的檢測結果和芯片的檢測結果，具有高達98%的符合率。在臨床實驗上，這樣的高符合率，能夠作為HBV病患抗病毒的給藥依據[6]。DNA的微陣列芯片法，即結核分支桿菌耐藥基因檢測實驗盒，針對異煙肼的耐藥因素進行精確的檢測，能夠確定臨床試驗當中，結核患者在分離的結核桿菌標本當中的藥敏現象，能夠針對結核患者的早期癥狀進行確診，并且能夠盡早介入和治療結核患者的初期癥狀，對于結核病人的預防和早期控制具有重要的意義和作用。

2.4 生物芯片信號檢測技術

在傳染病的檢測領域，物芯片信號檢測技術具有廣泛的應用，并且具有光明而廣闊的應用發(fā)展。但是，物芯片信號檢測技術的推廣和應用具有阻礙，原因在于芯片技術的欠發(fā)達導致的靈敏度較低的問題，和對于芯片的使用過程中，對于使用設備的要求較高。在這樣的現實狀況之下，物芯片信號檢測技術的發(fā)展還是取得了長足的進步和發(fā)展。對于普通的檢測需求，將有機熒光作為基礎的物芯片信號檢測手段非常便捷，方法也愈加成熟。但是熒光芯片還具有諸多問題，諸如：熒光芯片的靈敏度較低，熒光容易消失，需要利用特殊的掃描儀器才能實現信號的檢測等等。

3 核酸擴增技術

3.1 實時熒光PCR檢測技術

20年前，美國著名的Applied Biosystems公司發(fā)明并公布了實時熒光PCR檢測技術這一研究成果[7]。隨后，因為實時熒光PCR檢測技術的諸多優(yōu)勢，在有關傳染病的微生物實驗室方面，被世界領域一直被認為是最有效的方法。因此，獲得產品的批準較多。近些年來，實時熒光PCR檢測技術在急性呼吸方面疾病、甲型H1N1流行性感冒等新型的疾病當中，實時熒光PCR檢測技術能夠針對病原體進行精準的確認、檢測和治療，因此，其在新型突發(fā)疾病方面具有難以取代的地位。

實時熒光PCR檢測技術具有3個基本的化學原理類型：猝滅染料引物法、探針法以及DNA結合染料法。探針法以及DNA結合染料法能夠檢測出非特異反應產物，比如引物二聚體等，但是DNA結合染料法在傳染病的臨床試驗中的運用非常少見，其原因在于特異性較弱。探針法在我國傳染病的治療中應用較為廣泛。在檢測過程中，探針法利用熒光共振能量遷移來實現其功能和作用，但是探針法的應用范圍僅局限于特異性擴增，原因在于特異性較強。

3.2 核酸等溫擴增技術

近些年來，相關領域研究出體核酸等溫擴增技術，它是外核酸擴增技術，從始至終在同一個溫度下進行擴增反應，與PCR技術具有明顯不同之處。核酸等溫擴增技術的試驗流程非常簡單、便捷，也并不需要精確嚴密的控制溫度的實驗儀器，操作起來具有諸多優(yōu)點，比如：靈敏度高、反應快等等。在臨床試驗和要求速度的診斷行為中，具有廣闊而良好的發(fā)展前景。

4 生物傳感技術

生物傳感技術的構成是信號處理和生物感應兩種生物元件，它是用于各種生物和化學的反應檢驗系統(tǒng)。生物傳感技術是生物傳感器通過傳感標的物和生物傳感元件二者的互相作用而產生的信號，利用此信號對響應進行接受、加工，而后進行變換，再輸出，利用這樣的過程來對標的物實現檢驗和分析。

5 結語

當前，高通量的測序具有操作繁復、成本高、分析軟件欠完善等諸多問題，為其在病原體檢測方面的應用和發(fā)展帶來了問題。相信在工業(yè)級軟件和醫(yī)學軟件的不斷發(fā)展，能夠促進高通量測序逐漸變成病原體檢測的主流技術之一。利用生物芯片對傳染病分子進行診斷，此領域急需破解的技術難題，是生物芯片技術以及相關產品的研發(fā)。目前，生物芯片技術正向著微量、全自動、集成等方面發(fā)展。同時，我國關于傳染病分子診斷還具有諸多問題：①我國缺少具有自主創(chuàng)新的分子診斷技術。②我國分子診斷產品缺乏統(tǒng)一的質量標準，從而無法實現和保證檢驗結果的精確性。③普遍的分子診斷產品較多，缺少特殊病原體的檢驗產品。以上問題的解決，將有助于我國傳染病分子診斷領域的不斷發(fā)展。

[1]溫來欣.Luminex液相芯片在微生物多重檢測中的應用[J].職業(yè)與健康，2014，1（16）:2355-2358.

[2]王升啟.分子診斷技術在傳染病病原體檢測中的應用[J].傳染病信息，2014，10（5）:266-269.

[3]石瑩，田綠波，陳肖瀟，等.液相芯片技術在傳染病快速診斷中的應用[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2011，10（5）:422-426.

[4]張民秀，謝芝勛，鄧顯文，等.8種豬呼吸道和繁殖障礙病病原體GeXP檢測方法的建立[J].中國農業(yè)科學，2015，11（24）:4996-5006.

[5]張冬梅.熱帶傳染病診斷技術的研究進展[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2015，9（6）:443-449.

[6]趙笑，張冬梅.單克隆抗體和基因工程抗體在感染性疾病病原體檢測中的應用[J].中國病原生物學雜志，2016，3（8）: 3-6.

[7]王宇平，陳永義，張建明.液相芯片技術在人類傳染病檢測中的應用[J].現代預防醫(yī)學，2015，5（4）:708-709，716.

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1672-5654（2017）03（b）-0046-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.08.046

2016-12-10）

池曉峰（1979-），男，內蒙古赤峰人，碩士，主管檢驗師，主要從事臨床檢驗，免疫學檢驗等方面的工作。