孫喚，劉蓉，羅美庭

湘潭縣疾病預(yù)防控制中心，湖南湘潭 411228

人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理

孫喚，劉蓉，羅美庭

湘潭縣疾病預(yù)防控制中心，湖南湘潭 411228

為規(guī)范人感染H7N9禽流感病毒核酸實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)活動(dòng)，強(qiáng)化生物安全管理，防止內(nèi)部感染和交叉感染，該文參照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院424號(hào)令）等有關(guān)規(guī)定，結(jié)合實(shí)際情況，從檢測(cè)室布局到樣品處理分析等多方面闡述人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)生物安全管理要求，以供相關(guān)人員參考。

H7N9；核酸檢測(cè)；生物安全

H7N9禽流感病毒屬于甲型流感病毒中的一種亞型，可引發(fā)人類急性呼吸道感染，病情進(jìn)展到后期時(shí)可并發(fā)多種嚴(yán)重疾病，傳染源尚未確切證實(shí)，可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類（該實(shí)驗(yàn)室從確診病例密切接觸禽類的分泌物和排泄物中檢出多株H7N9陽(yáng)性病毒），傳播途徑可能是經(jīng)呼吸道、密切接觸感染禽類的分泌物或排泄物等途徑傳播，或通過(guò)接觸病毒污染的環(huán)境傳播至人，不排除有限的非持續(xù)的人傳人[1]。我國(guó)自從2013年3月31日在上海和安徽兩地發(fā)現(xiàn)全球首次病例以來(lái)，內(nèi)地共有19個(gè)省份累計(jì)報(bào)告H7N9病例1 000余例，死亡逾400例，病死率達(dá)高40%左右[2]。人感染H7N9禽流感危害程度大，重癥患者預(yù)后差、病死率高，且病毒可能發(fā)生變異形成人際間的傳播能力，其危害水平將極速增加[3]。在傳染源和傳播途徑等諸多因素不能明確的情況下，對(duì)其生物安全管理的若干問(wèn)題進(jìn)行初步探討，對(duì)強(qiáng)化生物安全，防范實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部感染和交叉感染，具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)室生物安全管理內(nèi)容

1.1 危害評(píng)估

實(shí)驗(yàn)室開展人感染H7N9禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)之前必須組織專業(yè)人員進(jìn)行危險(xiǎn)評(píng)估，基本內(nèi)容應(yīng)包括：標(biāo)本中可能的致病生物因子、傳播方式、感染性與致病性、對(duì)各種物理化學(xué)因子的敏感性、人體劑量反應(yīng)和危害程度，以及實(shí)驗(yàn)室的功能定位、涉及的人員、具體操作方法和過(guò)程等。根據(jù)評(píng)估結(jié)果確定相應(yīng)的防護(hù)級(jí)別。

1.2 生物安全管理綜合措施

加強(qiáng)管理，制定并健全與之相適應(yīng)的生物安全管理制度，應(yīng)包括：實(shí)驗(yàn)室安保和準(zhǔn)入、標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程、儀器使用和維護(hù)、實(shí)驗(yàn)室人員培訓(xùn)和考核、樣本采集運(yùn)輸與保存、實(shí)驗(yàn)室消毒和醫(yī)療廢棄物處理、陽(yáng)性標(biāo)本保存和處理、意外事故處理和報(bào)告、實(shí)驗(yàn)室人員健康體檢等。

1.3 生物安全設(shè)施和防護(hù)

配備開展H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)的各個(gè)功能區(qū)和主要設(shè)備，按防護(hù)要求進(jìn)行個(gè)體著裝，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程從事各類活動(dòng)。

2 實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別

①H7N9禽流感病毒暫未錄入《人間傳染的病原微生物名錄》（衛(wèi)生部衛(wèi)教科發(fā)[2006]15號(hào)），根據(jù)現(xiàn)有情況進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，疑似病例未經(jīng)培養(yǎng)的臨床樣本可在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)分裝、滅活和核酸提取，個(gè)人防護(hù)措施也應(yīng)達(dá)到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

②人感染H7N9禽流感病毒的分離培養(yǎng)和動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)應(yīng)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在此不作探討。

3 實(shí)驗(yàn)室布局

人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2004）和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)）等要求設(shè)置。

3.1 實(shí)驗(yàn)室主要布局

驗(yàn)室分可為3個(gè)獨(dú)立的工作區(qū)域（使用熒光素染色凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)則需分為4區(qū)，在此不做討論），即試劑儲(chǔ)存與準(zhǔn)備區(qū)、樣品提取區(qū)、基因擴(kuò)增和分析區(qū)，每區(qū)門口貼警示標(biāo)識(shí)，門可自動(dòng)閉合，設(shè)有一個(gè)緩沖間，物品通過(guò)傳遞窗按試劑儲(chǔ)存與準(zhǔn)備區(qū)、樣品提取區(qū)、基因擴(kuò)增和分析區(qū)單一流向進(jìn)行，避免各區(qū)之間交叉污染。

3.2 實(shí)驗(yàn)室主要設(shè)備

①試劑儲(chǔ)存與準(zhǔn)備區(qū)：-70℃低溫冰箱、超凈工作臺(tái)、紫外消毒燈，混勻器。②樣品提取區(qū)：生物安全柜、低溫高速離心機(jī)、-70℃低溫冰箱、高壓滅菌器、紫外消毒燈、洗眼裝置、混勻器。③基因擴(kuò)增和分析區(qū)：全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、紫外消毒燈。注：各區(qū)配有備用電源，應(yīng)急照明。

4 標(biāo)本采集、包裝運(yùn)輸和保存

4.1 標(biāo)本采集

H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)主要采集患者發(fā)病早期、未服用抗病毒藥物的咽拭子（還可采集深部痰液、呼吸道抽取物和支氣管灌洗液等標(biāo)本），操作人員必須規(guī)范操作，即要保證樣本質(zhì)量，還能防止病毒的傳播和擴(kuò)散。采樣開始前做好各項(xiàng)準(zhǔn)備工作，包括個(gè)人防護(hù)用品穿戴（鞋套、防護(hù)服、帽子、N95及以上水平醫(yī)用防護(hù)口罩、雙層醫(yī)用乳膠手套、隔離衣、面罩等），防護(hù)設(shè)施和采樣設(shè)備的配備等。采集咽拭子時(shí)，操作人員用壓舌板輕壓舌部，同時(shí)用專用采樣棉簽準(zhǔn)確快速擦拭患者雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子插入裝有含有3 mL采樣液的管中，棄去尾部，旋緊瓶蓋[4]。并對(duì)樣品的種類、來(lái)源、采集方法和日期等做詳細(xì)記錄。樣本采集完成后，將產(chǎn)生的醫(yī)療廢物分類收集于生物廢物袋，帶回實(shí)驗(yàn)室（或在有條件的采樣現(xiàn)場(chǎng)）進(jìn)行高壓蒸汽消毒處理。

4.2 樣本包裝與運(yùn)輸

H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)的樣品按照B類感染性物質(zhì)進(jìn)行包裝和運(yùn)輸，操作人員應(yīng)當(dāng)經(jīng)過(guò)專業(yè)知識(shí)和技能操作培訓(xùn)并考核通過(guò)，采用三層包裝系統(tǒng)（由內(nèi)到外分別為內(nèi)層容器、中層包裝和外層包裝），包裝和標(biāo)記過(guò)程中操作人員可采用上述樣品采集過(guò)程中的防護(hù)水平進(jìn)行個(gè)人防護(hù)。完善相關(guān)運(yùn)輸申請(qǐng)手續(xù)，專人轉(zhuǎn)車運(yùn)送。

5 樣本接收、保存和檢測(cè)

5.1 樣本接收、保存

樣本交接相關(guān)工作在實(shí)驗(yàn)室清潔區(qū)域完成。再由專業(yè)人員穿戴個(gè)人防護(hù)裝備后在樣品提取區(qū)的二級(jí)生物安全柜內(nèi)開啟包裝，檢查包裝狀態(tài)（有異常情況應(yīng)馬上啟動(dòng)意外事故處理和報(bào)告程序），消毒內(nèi)層容器表面，核對(duì)樣本信息，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。操作過(guò)程注意動(dòng)作輕柔，防止損壞內(nèi)層容器，如有容器破損或內(nèi)容物溢出等異常情況發(fā)生，應(yīng)馬上啟動(dòng)意外事故處理和報(bào)告程序。如樣品需暫緩檢測(cè)，可于2～8℃保存3 d；-20℃保存6個(gè)月；-70℃保存12個(gè)月。

5.2 樣本檢測(cè)和保存

操作人員必須經(jīng)過(guò)專業(yè)知識(shí)和技能操作培訓(xùn)合格后才能上崗，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前，須穿戴好個(gè)人防護(hù)設(shè)備，包括隔離衣、防護(hù)服、N95及以上水平醫(yī)用防護(hù)口罩和雙層醫(yī)用乳膠手套等。各功能區(qū)嚴(yán)格區(qū)分，物品、防護(hù)裝備專用。試劑準(zhǔn)備在試劑儲(chǔ)存與準(zhǔn)備區(qū)的超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)管配制完成后加蓋，通過(guò)傳遞窗傳送到樣品提取區(qū)；樣品處理在Ⅱ區(qū)的生物安全柜中進(jìn)行，操作時(shí)動(dòng)作輕緩，減少氣泡產(chǎn)生，加樣工作結(jié)束后將反應(yīng)管通過(guò)傳遞窗送至基因擴(kuò)增和分析區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增與分析。每次實(shí)驗(yàn)完成后工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品用10%次氯酸鈉（或其他等效消毒劑）擦拭消毒，再開啟紫外燈消毒處理。活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的各種廢棄物，如使用過(guò)的槍頭、反應(yīng)管等，高壓蒸汽消毒后再運(yùn)出實(shí)驗(yàn)室集中處置。操作和處理符合《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》相關(guān)要求。剩余樣本保存在Ⅱ區(qū)的-70℃低溫冰箱，詳細(xì)登記相關(guān)信息，雙人雙鎖管理。無(wú)需留存的標(biāo)本視同感染性廢棄物高壓蒸汽消毒處理。

6 實(shí)驗(yàn)室安保和準(zhǔn)入

制定實(shí)驗(yàn)室安保和準(zhǔn)入制度并落實(shí)到位，禁止無(wú)關(guān)人等進(jìn)入PCR實(shí)驗(yàn)室，培訓(xùn)學(xué)習(xí)等非常規(guī)狀況下進(jìn)入須有帶教老師或?qū)嶒?yàn)室負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)，并遵守實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)定。凡是進(jìn)行PCR檢驗(yàn)相關(guān)活動(dòng)的工作人員必須有體檢健康證明，掌握最新的生物安全防護(hù)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，了解實(shí)驗(yàn)潛在風(fēng)險(xiǎn)，并經(jīng)培訓(xùn)取得相應(yīng)的資格證書。在工作區(qū)域進(jìn)行檢驗(yàn)相關(guān)活動(dòng)時(shí)，要自覺接受生物安全員的管理和監(jiān)督。

7 儀器使用和維護(hù)

每次實(shí)驗(yàn)完畢后填寫儀器使用相關(guān)記錄并簽名，包括儀器運(yùn)行狀況，操作內(nèi)容和環(huán)境溫濕度條件等；制定相關(guān)儀器維護(hù)流程與周期，定期維護(hù)，填寫維護(hù)記錄。當(dāng)儀器出現(xiàn)異常不能自行處理時(shí)，報(bào)儀器廠家維修處理，維修人員必須按照二級(jí)生物安全個(gè)人防護(hù)水平穿戴，以保證其安全。

8 生物安全事故處理

實(shí)驗(yàn)室要制定行之有效的生物安全事故處理辦法，確保儲(chǔ)存的消毒劑足量有效，當(dāng)生物安全事故發(fā)生后，當(dāng)事人應(yīng)馬上將情況向?qū)嶒?yàn)室生物安全負(fù)責(zé)人如實(shí)匯報(bào)，并立刻選擇相應(yīng)的生物安全事故處理措施，盡量縮小意外事故的影響范圍和嚴(yán)重程度。

人類歷史上發(fā)生過(guò)許多次重大流行性疾病爆發(fā)，像鼠疫、流行性感冒、霍亂、SARS等等[5]，每次都給人類帶來(lái)了巨大的生命和財(cái)產(chǎn)損失，因此人們開始探究有效方法，從宏觀調(diào)控預(yù)防到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)研究，試圖多途徑控制各種傳染病。實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)早期，實(shí)驗(yàn)室生物安全并沒(méi)有引起足夠的重視，人們普遍忽視實(shí)驗(yàn)室感染問(wèn)題，指導(dǎo)性文件和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)缺乏，實(shí)驗(yàn)室生物安全管理體系不健全，規(guī)章制度執(zhí)行不到位，生物安全意識(shí)淡薄。2004年，某國(guó)家級(jí)病毒病研究機(jī)構(gòu)的一名研究生在從事實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)時(shí)被SARS冠狀病毒感染，并出現(xiàn)了第三代感染，造成了9例致病1例死亡的嚴(yán)重后果，引發(fā)了人們對(duì)生物安全問(wèn)題高度關(guān)注，從此開啟了我國(guó)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理體系的建立和完善工作。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理體系的創(chuàng)建，首先要明確目標(biāo)，即確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)及有關(guān)活動(dòng)的中人員與環(huán)境不受實(shí)驗(yàn)對(duì)象感染，安全處理具有傳染性的物質(zhì)和樣品，實(shí)驗(yàn)室人員熟悉和掌握相關(guān)安全知識(shí)和實(shí)踐操作技術(shù)。再圍繞目標(biāo)構(gòu)建一系列框架使其得以實(shí)現(xiàn)，包括機(jī)構(gòu)、人員、資源和體系文件等。

[1]人感染H7N9禽流感診療方案[Z].國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委辦公廳，2014.

[2]朱聞斐，高榮保,王大燕,等.H7亞型禽流感病毒概述[J].病毒學(xué)報(bào),2013（3）:245-249.

[3] 曹彬.人禽流感 H7N9、H5N1、H10N8臨床特征[J].生命科學(xué),2015（5）:549-553.

[4]劉峰.臨床護(hù)理實(shí)踐指南[M].2011版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2011.

[5]牛亞華.歷史上人類與傳染病的斗爭(zhēng)[J].科學(xué)之友,2006（1）：30-36.

R7

A

1672-5654（2017）06（a）-0058-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.16.058

2017-03-09）

孫喚（1982-），男，湖南岳陽(yáng)人，本科，主管檢驗(yàn)師，研究方向：衛(wèi)生檢驗(yàn)。