郭娟娟，盧 旭，曾紹校，張龍濤，李慶旺，郭玉丹，鄭寶東

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州福建350002)

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化Thalassospira sp.Fjfst-332產(chǎn)κ-卡拉膠酶的發(fā)酵條件

郭娟娟，盧 旭，曾紹校，張龍濤，李慶旺，郭玉丹，鄭寶東

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州福建350002)

為提高海旋菌Thalassospira sp.Fjfst-332產(chǎn)κ-卡拉膠酶的能力，采用單因素試驗法和響應(yīng)面分析法對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的條件下，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH、裝液量、接種量、溫度和轉(zhuǎn)速對κ-卡拉膠酶合成的影響，再選取溫度、pH和接種量3個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化.結(jié)果表明，κ-卡拉膠酶在培養(yǎng)基初始pH 7、接種量3 mL、裝液量30 mL、轉(zhuǎn)速150 r·min－1、溫度25℃的條件下，其酶活力最佳，為106 U·mL－1.

海旋菌Thalassospira sp.Fjfst-332；κ-卡拉膠酶；響應(yīng)面分析法

卡拉膠是一種硫酸線性多糖，其來源豐富，存在于沙菜、杉藻、麒麟菜和角叉菜等多種紅藻中[1].卡拉膠低聚糖及其衍生物在抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗?jié)?、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等方面有獨特的作用.降解卡拉膠獲得卡拉膠低聚糖的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法3種.物理法效率低且產(chǎn)物不容易控制；而化學(xué)法的副產(chǎn)物多，反應(yīng)條件不易控制，且容易污染環(huán)境；生物法是利用各種酶，或者借助產(chǎn)酶微生物的發(fā)酵作用，從而降解卡拉膠或降解富含卡拉膠的海藻，具有專一性強、作用條件溫和、環(huán)境污染少和產(chǎn)物得率高等諸多優(yōu)點，已成為卡拉膠海藻低聚糖的研究重點[2].

卡拉膠酶是一類多糖水解酶，按酶解底物專一性的不同劃分，卡拉膠酶分為λ-卡拉膠酶、κ-卡拉膠酶和ι-卡拉膠酶等.κ-卡拉膠酶屬于16族糖苷水解酶(GH16)，λ-卡拉膠酶則為新族糖苷水解酶，ι-卡拉膠酶歸屬于82族糖苷水解酶(GH82)[3].目前，能夠有效降解卡拉膠的大多數(shù)是海洋細(xì)菌，如弧菌屬Vibrio[4]、交替單胞菌屬Alteromonas[5]、假單胞菌屬Pseduomonas[6]和噬纖維菌屬Cytophaga[7]等.牟海津[8]于2003年在海洋環(huán)境中篩選到一株具有較高活性的卡拉膠降解菌，并對其進(jìn)行復(fù)合誘變選育，成功培育出一株酶活力明顯提高的突變株M2-4-4.Khambhaty et al[9]于2007年采集了印度Gujarat西海岸腐爛的海藻，通過對其沉積物樣品進(jìn)行分離，成功得到了一株κ－卡拉膠酶產(chǎn)生菌，并通過16S rDNA鑒定為Pseudomonas elongate.目前，產(chǎn)卡拉膠酶細(xì)菌研究最廣泛的為假交替單胞菌屬，海洋微生物資源繼續(xù)開發(fā)的空間仍非常寬廣.

本實驗室從角叉菜表面分離獲得一株可有效降解κ－卡拉膠多糖的海旋菌Thalassospirasp.Fjfst-332，其降解κ-卡拉膠的功能在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見報道.本試驗通過單因子篩選和響應(yīng)面優(yōu)化，有效提高了該菌κ-卡拉膠酶的酶活力，旨在為進(jìn)一步開發(fā)κ-卡拉膠低聚糖及研究其功能活性提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 海旋菌Thalassospirasp.Fjfst-332由本實驗室分離鑒定，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心.

1.1.2 試劑與儀器 試劑有κ-卡拉膠，BR級，為北京Solarbio公司產(chǎn)品.儀器有紫外可見分光光度計(北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司)、DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床(上海杜科自動化設(shè)備有限公司)、PB-10 pH計(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、HC014-11-01滅菌鍋(上海東亞壓力容器制造有限公司)和H-1850R離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司).

1.1.3 培養(yǎng)基 傳代培養(yǎng)基[8，10](改良2216E培養(yǎng)基):5 g·L－1蛋白胨、15 g·L－1κ-卡拉膠、1 g·L－1酵母膏、200 mL蒸餾水、800 mL人工海水，pH＝7.5.

復(fù)篩/產(chǎn)酶培養(yǎng)基[8，11]:15 g·L－1NaCl、1 g·L－1酵母膏、2 g·L－1κ-卡拉膠、100 mL無機鹽母液，pH 7.5.其中，無機鹽母液含20 g·L－1NaNO3、5 g·L－1MgSO4·7H2O、10 g·L－1K2HPO4、1 g·L－1CaCl2，pH＝7.5.

1.2 菌種的活化

將保存的菌株Fjfst-332接種于斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)24 h.使用規(guī)格為250 mL的錐形瓶，將斜面上生長良好的菌株接種到30 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，于30℃、150 r·min－1搖床培養(yǎng)24 h，再取1 mL發(fā)酵液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30℃、150 r·min－1搖床培養(yǎng)24 h，制成種子液.

1.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.1 培養(yǎng)基初始pH的確定 在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽緩沖液，并控制培養(yǎng)基的初始pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，在30℃、150 r·min－1的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，檢測菌體的生長量及上清液的酶活力，確定最適的培養(yǎng)基初始pH.

1.3.2 裝液量的確定 用規(guī)格為250 mL的錐形瓶，裝液量分別為10、20、30、40、50和60 mL，在30℃、150 r·min－1的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，檢測菌體的生長量及上清液的酶活力，確定最適的裝液量.

1.3.3 接種量的確定 根據(jù)確定的最適裝液量設(shè)定接種量分別為1、2、3、4、5和6 mL，在30℃、150 r· min－1的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，檢測菌體的生長量及上清液的酶活力，確定最適的接種量.

1.3.4 培養(yǎng)溫度的確定 在上述試驗確定的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗，將接種后的菌株分別放在20、25、30、35和40℃，轉(zhuǎn)速為150 r·min－1的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，檢測菌體的生長量及上清液的酶活力，確定最適的發(fā)酵培養(yǎng)溫度.

1.3.5 轉(zhuǎn)速的確定 在上述試驗確定的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗，將接種后的菌株分別放在100、125、150、175、200和225 r·min－1，25℃的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，檢測菌體的生長量及上清液的酶活力，確定最適的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速.

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以κ-卡拉膠酶活力為響應(yīng)值，A(溫度)、B(pH)和C(接種量)為自變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，設(shè)置三因素三水平響應(yīng)面試驗，試驗共設(shè)17個試驗點.其中，12個為分析因子，5個為零點，零點試驗進(jìn)行5次，以估計誤差.試驗以隨機次序進(jìn)行，重復(fù)3次，取平均值[12].

表1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計的因素水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 酶活力的測定 以反應(yīng)液中還原糖的增加量作為檢測κ-卡拉膠酶活力的指標(biāo).取1 mL發(fā)酵液加入到5 mL 0.2%κ-卡拉膠底物中，于30℃水浴反應(yīng)1 h，對照組用1 mL滅活酶液和5 mL底物溶液混合.還原糖的產(chǎn)生量采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定.取1 mL反應(yīng)液與1 mL 3，5-二硝基水楊酸混合，沸水浴反應(yīng)5 min后，冷卻，定容至10 mL，以滅活反應(yīng)液為對照，于540 nm波長下測定光密度(D).以半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)反應(yīng)組和對照組D的差值計算還原糖的產(chǎn)生量[8].1個酶活力單位(U)定義為:在30℃下，1 min產(chǎn)生1 μg還原糖(以半乳糖計)所需要的酶量.

式中，640.5、13.99:還原糖計算公式系數(shù)；V:酶添加量＋底物的體積(mL)；n:稀釋倍數(shù)；v:酶添加量(mL)；T:降解時間(min).

1.5.2 細(xì)菌生長量的測定 采用比濁法測定細(xì)菌的生長量.比濁法的原理:在一定范圍內(nèi)，懸液中的細(xì)菌濃度與混濁度成反比，與D成正比，菌越多，D越大.采用分光光度計測定600 nm波長下細(xì)菌懸液的D，以D表示菌量.

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用Design Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶能力的影響

卡拉膠在水溶液中會先形成膠粒狀態(tài)，而膠粒周圍會進(jìn)一步形成膠膜，使其很難均勻地分散在水中.適當(dāng)調(diào)節(jié)溶劑的pH，能促進(jìn)卡拉膠更好地溶解，其中，κ-卡拉膠在弱堿性和中性介質(zhì)中具有較好的分散性[13].培養(yǎng)基的初始pH也強烈影響營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運輸和菌體代謝酶的活性.本試驗將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)整為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，考察pH對菌株生長和產(chǎn)酶能力的影響.結(jié)果(圖1)表明，pH對于κ－卡拉膠酶活力的影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH為7.0時，酶活力最高，同時菌體的生長也達(dá)到最佳狀態(tài).

2.2 裝液量對產(chǎn)酶能力的影響

裝樣量不僅會影響發(fā)酵過程中的通氣量，同時也會影響到菌體與營養(yǎng)物之間的接觸程度[14－15].本試驗在250 mL錐形瓶中分別加入10、20、30、40、50和60 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時間后觀察不同的裝液量對菌株生長和產(chǎn)酶能力的影響.結(jié)果(圖2)表明，裝液量為30 mL時，菌株降解κ-卡拉膠的能力最強，裝液量過少或過多的效果均較不理想，此結(jié)果與菌株P(guān)seudoalteromonassp.AJ5發(fā)酵培養(yǎng)時，裝液量對酶活力的影響[14]較為相似.因為在搖瓶培養(yǎng)的過程中，若裝液量太少，會導(dǎo)致培養(yǎng)基剪切力增大，從而減緩菌株的生長速度，進(jìn)而限制產(chǎn)酶[11]，而裝液量過多，則會降低培養(yǎng)基的通氣量.

2.3 接種量對產(chǎn)酶能力的影響

一般來說，隨著接種量的增大，菌體生長的延滯期會相應(yīng)縮短.為了縮短生產(chǎn)周期，發(fā)酵工業(yè)上一般會選用較大的接種量[6].本試驗將接種量分別設(shè)置為1、2、3、4、5和6 mL，考察接種量對菌株生長和產(chǎn)酶能力的影響.結(jié)果(圖3)表明，當(dāng)接種量為3 mL時，菌株產(chǎn)酶能力最強，接種量過少或過多均不利于菌株產(chǎn)酶.接種量過多會使菌體繁殖過快，從而加速衰老，因此不利于產(chǎn)酶[12].當(dāng)接種量為4 mL時，菌體生長量達(dá)到最大值，但此時酶活力下降，可能由于菌株利用專一底物產(chǎn)酶時產(chǎn)生了底物競爭，抑制了酶活力.

2.4 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶能力的影響

搖瓶轉(zhuǎn)速會影響發(fā)酵液中的通氣量和內(nèi)溶氧量[1，8].本試驗將轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100、125、150、175、200和225 r·min－1，考察轉(zhuǎn)速對菌株生長和產(chǎn)酶能力的影響.結(jié)果(圖4)表明，轉(zhuǎn)速為150 r·min－1時，菌株產(chǎn)酶能力最強.適當(dāng)?shù)卦黾愚D(zhuǎn)速，有利于提高發(fā)酵瓶的通氣量和內(nèi)溶氧量，并加快菌體利用培養(yǎng)基的速度，從而提高產(chǎn)酶能力；而轉(zhuǎn)速過低會降低發(fā)酵液中的通氣量，形成不利菌體生長的環(huán)境，菌體產(chǎn)酶能力受到影響.轉(zhuǎn)速過高酶活力略有下降，可能是由于搖瓶內(nèi)培養(yǎng)基的剪切力過大[14].

2.5 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶能力的影響

溫度對菌株生長和產(chǎn)酶能力的影響很大.本試驗考察不同溫度(20、25、30、35、40℃)對菌株生長和產(chǎn)酶能力的影響.結(jié)果(圖5)表明，當(dāng)溫度達(dá)到25℃時，產(chǎn)酶能力最強，為菌株的最適生長溫度，與PseudoalteromonasWZUC10的最適發(fā)酵溫度[11]相似.當(dāng)溫度較低時，κ-卡拉膠溶解性差，菌株的生長活動受到抑制，進(jìn)而影響其產(chǎn)酶能力；當(dāng)溫度過高時，容易使菌株蛋白質(zhì)核酸變性，菌株大量死亡，影響其產(chǎn)酶能力.

2.6 菌株Fjfst-332發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.6.1 響應(yīng)面分析結(jié)果與方差分析 響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2所示.采用Design Expert V8.0.6軟件對κ-卡拉膠酶活力的回歸模型進(jìn)行顯著性分析.結(jié)果顯示，模型的P＜0.000 1，表明回歸模型顯著，且該模型的R2＝94.87，R2Adj＝97.26%，說明模型具有較好的擬合度.建立的二次響應(yīng)面回歸方程為:

酶活力＝105.60－2.29A＋4.43B－2.04C＋2.01AB＋0.99AC＋1.72BC－5.41A2－6.50B2－8.58C2

該方程一階主項A、B、C(P＜0.01)均為極顯著項，這與之前的單因素分析結(jié)論相吻合；二階項的A2、B2、C2(P＜0.01)為顯著項且均為負(fù)值，說明方程的拋物線函數(shù)開口向下，具有極大值點可進(jìn)行優(yōu)化分析.方差分析(表3)表明，AB和BC對κ-卡拉膠酶活力的影響顯著(P＜0.05)，說明試驗有意義，失擬項值為0.095 2，不顯著，方程可以接受.采用Design Expert V8.0.6軟件對模型進(jìn)行優(yōu)化，得出在溫度24.18℃、pH 7.15、接種量2.90 mL的條件下，酶活力最高，為106.556 U·mL－1.考慮到實際操作的方便性，并結(jié)合單因素優(yōu)化條件，取溫度25℃、pH 7、接種量3 mL(重復(fù)5次)，得到的酶活力為106.333 U·mL－1，與估計值相比，相對誤差為0.21%，說明擬合模型優(yōu)化出的條件較為準(zhǔn)確.

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experiment design and result of response surface analysis

表3 回歸方程的方差分析1)Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

2.6.2 單因素的交互作用 由圖6～8可知，在不同的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，菌株Fjfst-332降解κ-卡拉膠的能力不同，其酶活力與單因素結(jié)果具有較好的一致性.各因素之間有一定的交互作用，其中，發(fā)酵溫度與pH (P＝0.016 4)、發(fā)酵pH與接種量(P＝0.030 9)之間的交互作用達(dá)到顯著水平.

圖6顯示:pH＜6.5時，曲線較為平緩，可能由于菌株不耐酸性環(huán)境，其降解κ-卡拉膠的能力沒有隨著溫度的提高而增加；pH＞7時，菌株降解κ-卡拉膠的能力隨著溫度的提高，上升幅度較大.圖7顯示，溫度與接種量的交互作用較低(P＞0.05)，溫度較低或者較高時，接種量對菌株降解κ-卡拉膠能力的變化趨勢是一致的.圖8顯示，隨著接種量的增加，菌株降解κ-卡拉膠能力的極大值點位置沿著pH＞7的方向移動，其數(shù)值緩慢增大到極大值后開始有下降的趨勢.說明隨著接種量的增加，降解能力提高，酶活力達(dá)到最佳狀態(tài)的pH接近于中性[12].

2.6.3 驗證試驗結(jié)果 進(jìn)一步驗證響應(yīng)面分析法及預(yù)測的可靠性，利用優(yōu)化的條件進(jìn)行3次發(fā)酵試驗，測得發(fā)酵液的酶活力為107.012 U·mL－1，菌株生長量(D600nm)為2.311，與模型的預(yù)測值十分接近，菌體濃度較優(yōu)化前有所提高，優(yōu)化后菌株Fjfst-332降解κ-卡拉膠的能力提高了1.98倍，說明響應(yīng)面分析法對菌株發(fā)酵條件優(yōu)化是準(zhǔn)確可靠的.

3 結(jié)論

采用單因素試驗法和響應(yīng)面分析法，對海旋菌Thalassospirasp.Fjfst-332的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化.在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法得到最佳的發(fā)酵條件為:溫度25℃、pH 7、接種量3 mL、裝液量30 mL、轉(zhuǎn)速150 r·min－1，此時酶活力最高，為106.333 U·mL－1.對發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行驗證的結(jié)果表明，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化海旋菌Thalassospirasp.Fjfst-332的發(fā)酵條件是可行的.106.333 U·mL－1的酶活力與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)的26.5 U·mL－1[16]、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)的6.788 U· mL－1[17]、黃桿菌屬(Flavobacterium)的149.8 U·mL－1[18]相比，具有較好的開發(fā)優(yōu)勢.本實驗室將進(jìn)一步通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方、建立發(fā)酵動力學(xué)模型及κ-卡拉膠酶的分離純化，以期提高菌株產(chǎn)酶能力及κ-卡拉膠酶單位比活力.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

Optimization of fermentation conditions of Thalassospira sp.Fjfst-332 for κ-carrageenase by response surface methodology

GUO Juanjuan，LU Xu，ZENG Shaoxiao，ZHANG Longtao，LI Qingwang，GUO Yudan，ZHENG Baodong
(College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China)

To increase the production of extracellular κ-carrageenase from marine bacteria Thalassospira sp.Fjfst-332，effects of initial pH，liquid volume，inoculation amount，temperature and shaking speed on enzyme activities were investigated on foundation culture medium based on single factor test.Then interations between temperature，pH and inoculation amount on enzyme activities were determined by response surface analysis to optimize fermentation condition.Results showed that the medium with 3 mL inoculums，30 mL liquid，initial pH of 7 and shaken at 150 r·min－1under 25℃，was attributed to optimal enzyme activity of κ-carrageenase at 106 U·mL－1.

Thalassospira sp.Fjfst-332；κ-carrageenase；response surface analysis

Q939.9

:A

:1671-5470(2016)06-0706-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.06.016

2016－01－04

:2016－03－04

福建省科技計劃重點項目(2014I0008)；福建省科技重大專項(2015NZ0001-1)；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201505033).

郭娟娟(1989－)，女，博士研究生.研究方向:食品科學(xué)與工程.Email:gjjfst15＠163.com.通訊作者鄭寶東(1967－)，男，教授.研究方向:食品科學(xué).Email:zbdfst＠163.com.