朱秋強(qiáng)，于曙光，柯蘭蘭，潘大仁

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109)

轉(zhuǎn)基因水稻葉片外卷突變體的機(jī)理

朱秋強(qiáng)1，于曙光2，柯蘭蘭1，潘大仁1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109)

以水稻品種明恢86和明恢86轉(zhuǎn)基因水稻正常葉植株為對(duì)照組進(jìn)行研究，對(duì)葉片橫截面組織結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，單位面積突變體外卷葉片的上表皮泡狀細(xì)胞數(shù)量增加，推測(cè)外卷是由于泡狀細(xì)胞數(shù)量增加引起的.遺傳分析結(jié)果顯示，該卷葉突變性狀是由隱性單基因突變引起的.外源基因在卷葉突變體中為單拷貝，并且外源基因與卷葉性狀共分離，說明卷葉性狀是T-DNA插入引起的.T-DNA插入位點(diǎn)分析結(jié)果顯示插入位點(diǎn)位于水稻第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的非基因區(qū)，是一個(gè)新的與水稻卷葉相關(guān)的突變位點(diǎn).

卷葉突變體；泡狀細(xì)胞；遺傳分析；基因定位

水稻是最主要的糧食作物之一，尤其在中國(guó)這樣的人口大國(guó)，在耕地有限的情況下，穩(wěn)定和提高水稻單產(chǎn)就成為提高水稻產(chǎn)量最有效的途徑之一，而改良水稻株型對(duì)提高水稻單產(chǎn)具有重要意義.水稻葉片的直立性和葉片的適度卷曲是水稻理想株型的重要因素，葉片的適度內(nèi)卷能使葉片保持直立不披垂，從而減少葉片之間的互相遮擋，改善水稻群體的受光狀況.近年來，越來越多的科學(xué)家開始關(guān)注水稻卷葉性狀，致力于分離卷葉相關(guān)基因和探索水稻卷葉的相關(guān)機(jī)制.迄今為止已經(jīng)分離克隆到了13個(gè)與水稻卷葉相關(guān)的基因[1－13]，研究表明，卷葉性狀的成因大部分與泡狀細(xì)胞的發(fā)育異常相關(guān).NRL1和RL14基因分別編碼纖維素合酶和2GO-Fe(Ⅱ)加氧酶，它們對(duì)泡狀細(xì)胞的發(fā)育起正調(diào)控作用，這2個(gè)基因缺失的突變體導(dǎo)致水稻泡狀細(xì)胞的面積變小從而引起水稻葉片內(nèi)卷[3].此外，ACL1基因編碼一個(gè)含有保守功能域的未知蛋白，OsZHD1基因編碼一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)同源結(jié)構(gòu)域類轉(zhuǎn)錄因子，它們對(duì)水稻泡狀細(xì)胞的發(fā)育也起到正調(diào)控作用.這2個(gè)基因的過表達(dá)導(dǎo)致水稻泡狀細(xì)胞數(shù)量的增加，從而引起水稻葉片外卷[4，13].SLL1基因編碼一個(gè)MYB家族的SHAQKYF類轉(zhuǎn)錄因子，sll1突變體的葉片遠(yuǎn)軸面后壁細(xì)胞發(fā)育缺陷和遠(yuǎn)軸面泡狀細(xì)胞異常發(fā)育引起葉片內(nèi)卷[8].Roc5基因負(fù)調(diào)控泡狀細(xì)胞的形成和發(fā)育，其缺失表達(dá)導(dǎo)致上表皮泡狀細(xì)胞數(shù)量增多而引起水稻葉片外卷[10].SRL1基因表達(dá)一個(gè)糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，該基因?qū)λ九轄罴?xì)胞的發(fā)育起到負(fù)調(diào)控的作用，當(dāng)其不表達(dá)的時(shí)候泡狀細(xì)胞的數(shù)量增多[12].可見泡狀細(xì)胞的發(fā)育對(duì)于水稻葉片的形態(tài)維持具有重要作用.

對(duì)泡狀細(xì)胞發(fā)育的相關(guān)分子機(jī)制的探索是了解水稻卷葉分子機(jī)制的一個(gè)重要突破口.然而，已經(jīng)克隆到的與水稻卷葉性狀相關(guān)的基因未能形成一個(gè)有效的分子網(wǎng)絡(luò)，無法說明水稻泡狀細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制.因此，為了了解水稻泡狀細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制，需要分離更多的相關(guān)基因以形成完整的分子網(wǎng)絡(luò).本研究以轉(zhuǎn)基因水稻穩(wěn)定高代中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)葉片外卷的突變體為材料，探討與卷葉發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞學(xué)與分子機(jī)制.以期為進(jìn)一步研究和利用水稻卷葉性狀提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的轉(zhuǎn)3α-HSD基因水稻穩(wěn)定高代葉片外卷突變體(Rolled)、轉(zhuǎn)3α-HSD基因水稻穩(wěn)定高代正常平展葉植株(Unrolled)和轉(zhuǎn)基因受體水稻品種明恢86植株(WT).外源3α-HSD基因是睪丸酮叢毛單胞菌的關(guān)鍵酶3α-羥類固醇脫氫酶/碳?；€原酶基因，對(duì)環(huán)境污染物中的類固醇化合物有很好的降解作用.該卷葉突變體從第4片葉開始出現(xiàn)卷葉性狀，苗期葉型正常.試驗(yàn)材料均隔離種植于福建農(nóng)林大學(xué)試驗(yàn)田內(nèi)，按常規(guī)方法進(jìn)行田間管理.樣品采集時(shí)間為出現(xiàn)卷葉性狀的苗期末期與分蘗期初期之間.

1.2 水稻葉片石臘切片的組織觀察

分別取WT、Unrolled和Rolled 3個(gè)材料的苗期第4或第5片葉片進(jìn)行石蠟切片分析.首先把剪下來的葉片剪成約1 cm的小段，置于預(yù)先準(zhǔn)備好的固定液中，放置12 h以上；然后依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色和中性樹膠封片等操作，用顯微鏡觀察水稻葉片橫截面切片.

1.3 外源基因拷貝數(shù)的分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法確定轉(zhuǎn)基因水稻外源基因的拷貝數(shù)[14].引物用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成.實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用的引物為SPS-F:TTGCGCCTGAACGGATAT.SPS-R: CGGTTGATCTTTTCGGGATG.HSD-F:CAGCCGTCGTCATCTCGTCC.HSD-R:CCCGCATAGGCCAGATTTCC.定量PCR體系為SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL，上下游引物各0.4 μL，無菌蒸餾水7.2 μL，模板2 μL，總體積20 μL.PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃，10 s(循環(huán)數(shù)1).PCR反應(yīng):95℃，10 s；65℃，20 s.退火過程中檢測(cè)熒光值，進(jìn)行40個(gè)循環(huán).

1.4 T-DNA與突變性狀的共分離分析

采用篩選顯性純合株的方法觀察后代葉片表型，分別對(duì)100株自交后代進(jìn)行葉片形態(tài)觀察，后代均未出現(xiàn)卷葉突變體親本的為顯性純合株.經(jīng)過篩選獲得10株顯性純合株，另隨機(jī)選取20株卷葉植株，提取葉片DNA.T-DNA里包含3α-HSD基因，以3α-HSD基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，驗(yàn)證顯性純合株和隱性純合株中是否含有T-DNA.

1.5 T-DNA插入位點(diǎn)的分析

本試驗(yàn)采用TAIL-PCR法擴(kuò)增T-DNA側(cè)翼序列，然后通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)確定T-DNA在水稻基因組中的插入位點(diǎn).首先用3條嵌套的特異引物分別和簡(jiǎn)并引物組合，以Rolled的葉片基因組DNA為模板進(jìn)行TAIL-PCR，從而確定外源T-DNA插入位點(diǎn).常見的基因定位包括分子標(biāo)記法和QTL分析等[15－18]，本研究的材料為轉(zhuǎn)基因突變體，所以采用TAIL-PCR法.本研究轉(zhuǎn)基因水稻所用的3α-HSD基因表達(dá)載體為以pBR322質(zhì)粒載體構(gòu)建的pBRHSD表達(dá)載體，由本研究室保存.根據(jù)表達(dá)載體序列設(shè)計(jì)T-DNA兩端的3對(duì)特異引物，進(jìn)行側(cè)翼序列的TAIL-PCR擴(kuò)增，所涉及的引物見表1.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻葉片的形態(tài)觀察

觀察不同生長(zhǎng)期不同水稻材料間葉片和株型的差異情況.從圖1可以看出正常水稻葉片是平展的，而卷葉突變體的葉片明顯向外卷曲呈半筒狀.

表1 TAIL-PCR引物Table 1 Primers of TAIL-PCR

2.2 水稻葉片橫截面結(jié)構(gòu)的差異

于苗期選取幼嫩的葉片進(jìn)行石蠟切片分析，結(jié)果見圖2.從圖2可以看出，卷葉突變體的上皮層小側(cè)脈旁的泡狀細(xì)胞數(shù)目明顯多于正常葉片的上皮層小側(cè)脈旁的泡狀細(xì)胞.上皮層泡狀細(xì)胞是水稻葉片在不缺水時(shí)保持葉片平展的重要組織結(jié)構(gòu)，而過多的上皮層泡狀細(xì)胞則會(huì)導(dǎo)致葉片向反軸面卷曲，即葉片外卷.

2.3 卷葉性狀的遺傳性

以Rolled和WT互為父本和母本進(jìn)行雜交獲得F1代植株，記為Rolled/WT和WT/Rolled.葉片形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株均為平展葉片，沒有出現(xiàn)卷葉性狀.F1代自交得到F2代，觀察F2代的葉片形態(tài)，其分離情況見表2.

表2 F1性狀表現(xiàn)及F2群體分離情況Table 2 Phenotypic expression of F1and segregation status of F2population

從表2可以看出，2個(gè)雜交組合Rolled/WT和WT/Rolled的F1代葉型均為平展葉，Rolled/WT和WT/ Rolled的F2代群體葉型為平展葉.卷葉的數(shù)量比分別為266∶86和292∶92，按1對(duì)等位基因的分離模式進(jìn)行3∶1擬合卡方檢驗(yàn)，Rolled/WT和WT/Rolled的X2(3∶1)分別為0.854和0.680，均小于(3.841)，符合3∶1的孟德爾的單基因遺傳分離規(guī)律.由此可見，該外卷性狀是隱性單基因突變引起的.

2.4 外源基因拷貝數(shù)的確定

由于蔗糖磷酸合成酶基因SPS在水稻基因組中為單拷貝，所以選擇蔗糖磷酸合成酶基因SPS為對(duì)照基因檢測(cè)外源3α-HSD基因在轉(zhuǎn)基因后代中的拷貝數(shù).3α-HSD基因和SPS基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示.3α-HSD基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＝0.992 7，相關(guān)性高，所以3α-HSD基因Ct值與起始模板數(shù)(HSD0)之間的相關(guān)性方程為:HSD0＝10(－0.1424Ct＋4.39).SPS基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＝0.997 9，相關(guān)性高，所以SPS基因的Ct值與起始模板數(shù)(SPS0)之間的相關(guān)性方程為:SPS0＝10(－0.2738Ct＋7.82).

WT的3α-HSD基因的Ct值是24.84，SPS基因的Ct值是27.31，Rolled3α-HSD基因的Ct值是26.18，SPS基因的Ct值是27.25.由方程HSD0＝10(－0.141Ct＋4.3501)計(jì)算出樣品3α-HSD基因的起始模板數(shù)，由方程SPS0＝10(－0.274Ct＋7.9246)計(jì)算出樣品SPS基因的起始模板數(shù).計(jì)算得到的結(jié)果為:WT的HSD0＝20 195，SPS0＝80 139；Rolled的HSD0＝47 953，SPS0＝40 162.水稻內(nèi)參基因SPS是純合二倍體，本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因植株也是經(jīng)過篩選得到的卷葉突變純合株，所以3α-HSD基因也是純合二倍體.根據(jù)Ding的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法確定轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)，計(jì)算結(jié)果表明，WT中3α-HSD基因的HSD0/SPS0為0.252，拷貝數(shù)為0；Rolled中3α-HSD基因的HSD0/SPS0為1.194，拷貝數(shù)為1，即為單拷貝.

2.5 T-DNA與卷葉性狀的共分離檢測(cè)

遺傳分析結(jié)果表明，卷葉性狀是隱性單基因突變引起的，選取WT和Rolled的雜交后代F2代為研究材料，觀察卷葉性狀與3α-HSD基因的共分離情況.由于卷葉性狀是隱性單基因突變引起的，所以F2代中的平展葉植株中有雜合株的存在，需要先把F2代中的顯性純合株分離出來，最終分離得到10株顯性純合株.對(duì)顯性純合株和隱性純合株進(jìn)行3α-HSD基因的PCR驗(yàn)證.從圖4可以看出，顯性純合株都沒有TDNA，而隱性純合株都有T-DNA，由此可以推斷T-DNA與卷葉性狀共分離.

2.6 外源基因插入位點(diǎn)的確定

外源T-DNA插入位點(diǎn)分析結(jié)果表明:以T-DNA右邊界終止子nos序列設(shè)計(jì)的特異引物與簡(jiǎn)并引物的引物組合在3輪PCR之后沒有獲得條帶；而以T-DNA左邊界hpt基因序列設(shè)計(jì)的特異引物與簡(jiǎn)并引物的引物組合經(jīng)過3輪PCR，hpt/AD2-1引物對(duì)獲得1條500 bp左右的DNA條帶，hpt/AD3引物對(duì)獲得1條300 bp左右的DNA條帶，結(jié)果見圖5.回收條帶后，先用軟件DNAMAN進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)回收的DNA片段為T-DNA的側(cè)翼序列.比對(duì)結(jié)果顯示2個(gè)回收DNA條帶中只有hpt/AD3引物對(duì)獲得的300 bp左右的DNA條帶是T-DNA的側(cè)翼序列，而hpt/AD2-1引物對(duì)獲得的500 bp左右的DNA條帶不能與T-DNA末端序列配對(duì)，推測(cè)該擴(kuò)增DNA條帶是簡(jiǎn)并引物AD2-1自身配對(duì)擴(kuò)增獲得的非特異性條帶.hpt/AD3引物對(duì)獲得的300 bp左右的DNA條帶采用NCBI的Blastn程序進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該DNA片段與水稻9號(hào)染色體上的序列匹配率高達(dá)99%.進(jìn)一步檢索分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入位點(diǎn)位于水稻9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的7 504 113 bp處，處于非基因區(qū).

T-DNA插入位點(diǎn)前后100 kb以內(nèi)共有7個(gè)基因，其中上游基因?yàn)镺s09g0292900，下游6個(gè)基因，距離插入位點(diǎn)最近的基因是下游的Os09g0293400，這些基因的功能均未知.經(jīng)過同源性比對(duì)分析這些功能未知的基因，基因功能的預(yù)測(cè)結(jié)果如表3所示.

表3 T-DNA插入位點(diǎn)附近基因的功能預(yù)測(cè)Table 3 Prediction on function of genes near the insertion site of T-DNA

3 討論

本研究以轉(zhuǎn)基因水稻穩(wěn)定高代中發(fā)現(xiàn)的葉片外卷突變體植株為材料，以水稻栽培品種明恢86和明恢86轉(zhuǎn)基因水稻正常葉植株為對(duì)照組，進(jìn)行了葉片橫截面石蠟切片觀察、卷葉性狀遺傳分析和外源T-DNA插入位點(diǎn)確定等研究.結(jié)果表明，突變體外卷葉片的上表皮泡狀細(xì)胞數(shù)量增加造成葉片外卷；卷葉突變性狀是由隱性單基因突變引起的；外源基因在卷葉突變體中為單拷貝，并與卷葉性狀共分離；通過T-DNA插入位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與水稻卷葉相關(guān)的突變位點(diǎn).

外源基因3α-HSD在卷葉突變體中的拷貝數(shù)為單拷貝，外源基因3α-HSD和卷葉性狀共分離，外源TDNA插入位點(diǎn)位于水稻9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的7 504 113 bp處，處于非基因區(qū).外源基因?yàn)閱慰截惽液途砣~性狀共分離，說明卷葉突變是外源基因插入引起的.目前已發(fā)現(xiàn)的與水稻卷葉性狀相關(guān)的基因分布于不同的水稻染色體上，其中定位在水稻9號(hào)染色體上的基因有3個(gè).Zhang et al[8]發(fā)現(xiàn)一個(gè)控制水稻卷葉性狀的隱性基因sll1-1，并將其定位于第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上.sll1-1基因的缺失導(dǎo)致突變體水稻葉片的遠(yuǎn)軸面也出現(xiàn)了泡狀細(xì)胞，從而導(dǎo)致水稻葉片內(nèi)卷.Luo et al[11]也在一個(gè)內(nèi)卷水稻突變體中發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能與水稻卷葉相關(guān)的基因RL10(t)，并將其定位在9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上.Yan et al[7]發(fā)現(xiàn)一個(gè)葉片完全內(nèi)卷和小穗畸形的水稻突變體，通過圖位克隆得到一個(gè)位于9號(hào)染色體上的與卷葉相關(guān)的RL9基因.這3個(gè)基因分別定位在9號(hào)染色體上的不同的位點(diǎn)上，sll1-1基因位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂11 Mbp處，RL10(t)基因位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂13 Mbp處，RL9基因位于9號(hào)染色體16 Mbp處，而本研究中發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂7.5 Mbp處，且距離較遠(yuǎn)，基本可以排除與本研究突變位點(diǎn)共分離的可能性.因此可以推斷，本研究發(fā)現(xiàn)的與水稻卷葉相關(guān)的基因是一個(gè)新的與水稻外卷性狀相關(guān)的突變位點(diǎn).另外，已知的3個(gè)定位于9號(hào)染色體上的基因突變都造成水稻葉片內(nèi)卷，而本研究中的突變體為葉片外卷.新的與水稻外卷性狀相關(guān)的突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探究水稻卷葉性狀的相關(guān)分子機(jī)制提供了新的證據(jù).

本研究通過對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻后代卷葉突變體的研究發(fā)現(xiàn)該突變體的卷葉性狀是由于T-DNA的插入導(dǎo)致1對(duì)隱性基因發(fā)生突變，進(jìn)而造成泡狀細(xì)胞發(fā)育異常，最終導(dǎo)致水稻葉片外卷.T-DNA插入位點(diǎn)位于水稻第9號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上7.5 Mbp處的非基因區(qū)，通過對(duì)插入位點(diǎn)附近的基因進(jìn)行分析得到與水稻泡狀細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的候選基因.

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(責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉)

Preliminary investigation on outward rolled leaf mutant of transgenic rice

ZHU Qiuqiang1，YU Shuguang2，KE Lanlan1，PAN Daren1
(1.College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China；2.College of Chemistry and Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China)

Outward rolling leaf is likely to improve light interception rate of rice.To investigate cytology and molecular mechanism of this trait，mutant plants 3α-HSD with stable traits of outward rolling leaf were used as the experimental group，with cultivated variety MH 86 and transgenic plants with flat leaves used as the control.Microscopic observation on cross section of leaves indicated that rolled leaf of mutant plants was caused by an increased number of bulliform cells.Genetic analysis showed that outward rolling leaf was attributed to the mutation of single recessive genes.This exogenous gene was a single copy in rolled leaf mutant，and co-segregated with rolled leaf trait，indicating that rolled leaf trait was likely caused by T-DNA insertion.Furthermore，analysis of T-DNA insertion site showed that this insertion located in the non-coding region in long arm of chromosome 9，which was a new mutation site related to the mechanism of this trait，related to rice leaf rolling.

bulliform cell；curled leaf mutant；genetic analysis；TAIL-PCR

Q946

:A

:1671-5470(2016)06-0655-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.06.008

2016－06－20

:2016－08－21

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2008zx08009-003).

朱秋強(qiáng)(1986－)，男，博士研究生.研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué).Email:181426249＠qq.com.通訊作者潘大仁(1949－)，男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向:生物技術(shù).Email:pdr8598＠163.com.