徐 金，黃翠香，劉 青，毛云飛，倪 偉，于文章，沈 向（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東 泰安 271018）

平邑甜茶根毛細(xì)胞離子流動性對PAHs脅迫的響應(yīng)

徐 金，黃翠香，劉 青，毛云飛，倪 偉，于文章，沈 向*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東 泰安 271018）

以蘋果砧木-平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd）幼苗為實驗材料，采用營養(yǎng)液栽培，利用非損傷微測技術(shù)，研究多環(huán)芳烴（PAHs）中熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫處理對平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞Ca2+、K+、H+流速的影響.結(jié)果表明:（1）經(jīng)熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫處理后，平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞Ca2+平均流速由對照的（-63.53±9.30）pmol/（cm2·s）分別增加到（+62.85±10.00）pmol/（cm2·s）、（91.33±19.72）pmol/（cm2·s）；K+流速平均值由基礎(chǔ)流速（-60.56±14.56）pmol/（cm2·s）分別增至（+32.60±5.44）pmol/（cm2·s）、（+36.76±5.23）pmol/（cm2·s）；H+平均流速由對照的（+44.38±5.19）pmol/（cm2·s）分別降低至（-0.72±0.055）pmol/（cm2·s）、（-6.34±0.79）pmol/（cm2·s）.經(jīng)熒蒽及苯并（b）熒蒽處理，根毛細(xì)胞表面Ca2+、K+、H+流動性發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn).Ca2+、K+表現(xiàn)為外排趨勢，且外排量逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定；H+表現(xiàn)較穩(wěn)定的內(nèi)吸趨勢.（2）苯并（b）熒蒽脅迫對平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞離子流動性造成的毒性效應(yīng)高于熒蒽.說明PAHs脅迫會破壞植物根毛細(xì)胞離子流動性，影響植物正常生長，為深入研究植物受PAHs脅迫所產(chǎn)生的響應(yīng)提供理論依據(jù).

平邑甜茶；熒蒽；苯并（b）熒蒽；脅迫；離子流動性

多環(huán)芳烴（PAHs）是指2個或2個以上芳香環(huán)稠合成的有機(jī)污染物，在環(huán)境中普遍存在，具有致癌、致畸、致突變效應(yīng)［1-3］.隨著苯環(huán)數(shù)的增大，其水溶性越差，降解速度越低［4］.目前PAHs引起的環(huán)境問題已得到各國的廣泛關(guān)注，而土壤成為PAHs的重要歸宿，有研究表明滯留在土壤耕作層中的PAHs約達(dá)90%［5-6］.PAHs進(jìn)入土壤后可通過揮發(fā)、遷移以及食物鏈等途徑在生態(tài)系統(tǒng)中富集，影響植物生長，威脅人體健康及食品安全，也給其他生物造成嚴(yán)重危害［7-8］.現(xiàn)在PAHs種類已達(dá)100種以上，我國也將7種PAHs列入優(yōu)先控制污染物黑名單中［9］.近年來，我國經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展，卻忽視了對環(huán)境的保護(hù)，能源的高需求低利用導(dǎo)致PAHs排放量不斷增加，環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重［10］，所以廣泛開展我國生態(tài)環(huán)境中PAHs的研究具有重要意義.

熒蒽（Fla）和苯并（b）熒蒽（Bbf）是我國7種優(yōu)控PAHs的代表性化合物，熒蒽具有潛在的致癌性、弱致突變性及免疫毒性，會破壞生物體正常防御體系［11-12］，且能長時間殘留在土壤中，并通過食物鏈給生態(tài)環(huán)境帶來風(fēng)險［13］；苯并（b）熒蒽分子量較大，其光解、水解、生物降解很微弱，相對致癌性強(qiáng)，是檢驗食品中PAHs的標(biāo)記［14］.這2種物質(zhì)在土壤中含量較多，但目前有關(guān)這2種化合物對植物的毒性效應(yīng)尚未見報道.植物離子流的變化是反應(yīng)逆境脅迫后最初的快速信號，通過離子流可以快速診斷和預(yù)測細(xì)胞的關(guān)鍵發(fā)生過程，隨著非損傷微測技術(shù)（掃描離子選擇性微電極技術(shù)）的出現(xiàn)，離子跨膜流動的研究得到迅速發(fā)展［15-17］.本研究采用無融合生殖、抗性強(qiáng)的蘋果砧木-平邑甜茶幼苗為實驗材料，利用非損傷微測技術(shù)，檢測熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫處理對其幼苗根毛細(xì)胞Ca2+、K+、H+流速的影響，揭示PAHs對植物的毒性效應(yīng)，為深入研究植物受PAHs脅迫所產(chǎn)生的響應(yīng)提供理論依據(jù)，為PAHs的生態(tài)風(fēng)險評估積累基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)樣品：熒蒽（25mg，98.5%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司），苯并（b）熒蒽（10mg，99.0%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）熒蒽和苯并（b）熒蒽溶液配制：用甲醇溶解熒蒽、苯并（b）熒蒽，將熒蒽及苯并（b）熒蒽的甲醇儲備液加入適量的Hoagland半強(qiáng)度培養(yǎng)液中，振蕩均勻，定容在2L的容量瓶中（控制甲醇濃度＜1‰），制得濃度為0.2mg/L的熒蒽培養(yǎng)液和5μg/L的苯并（b）熒蒽培養(yǎng)液，在低溫條件下避光保存?zhèn)溆茫?8-21］.

1.2 材料處理

選取蘋果砧木-平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd）幼苗為供試材料，于2014年10月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹根系實驗室進(jìn)行水培試驗.

為保證試驗準(zhǔn)確性，所用平邑甜茶幼苗生長狀況應(yīng)一致且普遍長出5～7片真葉，對其進(jìn)行水培，水培期間加入適量Hoagland半強(qiáng)度營養(yǎng)液.啟動通氣設(shè)備，為植物生長提供良好環(huán)境.每7d換一次營養(yǎng)液，每盆加營養(yǎng)液2L.一個月后待幼苗適應(yīng)水環(huán)境后，株高10cm、長出4對葉片有大量白色吸收根長出時，采用非損傷微測技術(shù)檢測熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫下平邑甜茶幼苗根毛K+、Ca2+、H+流動性.非損傷微測試驗于2015年5月在旭月（北京）科技有限公司進(jìn)行.

1.3 試驗方法

測定方法：取平邑甜茶幼苗白色新生根尖1cm左右于培養(yǎng)皿，分別加入含0.2mg/L熒蒽和5μg/L苯并（b）熒蒽培養(yǎng)液處理15min，然后將幼苗根部放入測試液（Ca2+、K+、H+所用測試液相同）清洗根部，放根部于測試液中固定，對根尖部分生區(qū)周圍500μm進(jìn)行測定，檢測凈Ca2+、K+、H+離子流，每個測試點測2min，大約10min流速穩(wěn)定后，結(jié)束測試，重復(fù)5次.

利用非損傷微測技術(shù)，測定平邑甜茶根毛細(xì)胞表面Ca2+、K+、H+離子流變化.測試液配方：0.1mmol/LKCl，0.1mmol/LCaCl2,0.1mmol/LMgCl2，0.5mmol/LnaCl，0.2mmol/LNa2So4，0.3mmol/LME S，pH 6.0.測定前微電極前端灌充有15～25μm的選擇性液態(tài)離子交換劑（LⅠX）液柱，LⅠX分別為Ca2+（Sigma #21048）、H+（Sigma #95293）、K+（Sigma #60031），其后灌充10mm左右的電解質(zhì).電解質(zhì)為H+（15mmol/LNaCl+40mmol/L KH2PO4， pH 7.0），Ca2+（100mmol/L CaCl2）， K+（100mmol/L KCl）.將電極固定器（EHB-1； World Precision Ⅰnstruments）上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解質(zhì)接觸［22］.參比電極（DRⅠREF-2； World Precision Ⅰnstruments）為固體電極.選用校正中能斯特斜率＞56mV/decade H+微電極使用，校正液為pH5.5和pH6.5的緩沖液［23］.

1.4 數(shù)據(jù)分析

離子流數(shù)據(jù)通過旭月公司提供的MageFlux軟件計算得出.采用EXCEL對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用DPS v7.05軟件作不同處理之間差異顯著性差異分析.

2 結(jié)果

2.1 熒蒽和苯并（b）熒蒽對平邑甜茶根毛細(xì)胞Ca2+流動性影響

圖1為熒蒽，苯并（b）熒蒽脅迫處理后，10min內(nèi)平邑甜茶根毛細(xì)胞表面Ca2+流速變化.正值代表離子外排，負(fù)值代表離子吸收.從圖1可看出，根毛細(xì)胞在正常環(huán)境條件下有基礎(chǔ)性Ca2+吸收，進(jìn)行熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后，Ca2+流動性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為外排趨勢，外排量隨處理時間的延長逐漸降低，最終呈穩(wěn)定趨勢.此時經(jīng)熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫后的平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞Ca2+流速分別為（+38.08±8.33）pmol/（cm2·s）和（+52.27±9.21）pmol/（cm2·s）.

10min內(nèi)平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞Ca2+流速平均值為（-63.53±9.30）pmol/（cm2·s），經(jīng)熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫處理后，分別增加到（+62.85± 10.00）pmol/（cm2·s）和（91.33±19.72）pmol/（cm2·s），與對照差異顯著（P＜0.01）.分析2種處理可以看出，苯并（b）熒蒽脅迫對平邑甜茶Ca2+流動性的毒性效應(yīng)高于熒蒽.

圖1 熒蒽，苯并（b）熒蒽處理根毛細(xì)胞表面Ca2+流速變化Fig.1 Change of the cell surface Ca2+flow rate of root hair cells treated with fluoranthene and Benzo［b］fluoranthene

2.2 熒蒽和苯并（b）熒蒽對平邑甜茶根毛細(xì)胞K+流動性影響

從圖2可以看出，根毛細(xì)胞在正常環(huán)境中基礎(chǔ)性的K+吸收，受熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后，平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞K+流動性也發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為外排趨勢，起初流速迅速降低，后趨于穩(wěn)定.最終 流 速 達(dá) 到 （+23.55±6.74）pmol/（cm2·s）和（+32.15± 5.31）pmol/（cm2·s）.

平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞在受熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后，K+流速平均值由基礎(chǔ)流速（-60.56± 14.56）pmol/（m·s）分別增至（+32.60±5.44）pmol/（cm2·s）和（+36.76±5.23）pmol/（cm2·s），與對照差異極顯著（P＜0.01）.分析可以看出，2種脅迫處理對平邑甜茶幼苗K+流動性毒性效應(yīng)同樣是苯并（b）熒蒽高于熒蒽.

圖2 熒蒽，苯并（b）熒蒽處理根毛細(xì)胞表面K+流速變化Fig.2 Change of the cell surface K+flow rate of root hair cells treated with fluoranthene and Benzo［b］fluoranthene

2.3 熒蒽和苯并（b）熒蒽對平邑甜茶根毛細(xì)胞表面H+流動性影響

從圖3可以看出，根毛細(xì)胞表面H+在正常環(huán)境中表現(xiàn)為外排趨勢，受熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫后，H+流動性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為比較穩(wěn)定的內(nèi)吸趨勢.

測得平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞表面H+基礎(chǔ)流速平均為（+44.38±5.19）pmol/（cm2·s），經(jīng)熒蒽和苯并（b）熒蒽處理后，分別降低至（-0.72± 0.055）pmol/（cm2·s），（-6.34±0.79）pmol/（cm2·s），與對照差異極顯著（P＜0.01）.分析可以看出，苯并（b）熒蒽脅迫處理對平邑甜茶幼苗H+流動性造成的影響高于熒蒽.

圖3 熒蒽，苯并（b）熒蒽處理根部細(xì)胞表面H+流速變化Fig.3 Change of the cell surface H+flow rate of root hair cells treated with fluoranthene and Benzo［b］fluoranthene

3 討論

PAHs對植物的影響越來越引起人們的關(guān)注.Maria Ⅰsabel Cerezo等研究發(fā)現(xiàn)PAHs減少了原綠球藻的DNA合成，延緩其細(xì)胞分裂，導(dǎo)致原綠球藻生長量降低［24］.洪有為等［25］對秋茄幼苗進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)隨菲濃度加大，根細(xì)胞受傷害程度增加，根系活力下降，葉綠素a、b含量也呈下降趨勢.丁克強(qiáng)等［26］研究認(rèn)為苯并（a）芘污染土壤會抑制小麥種子發(fā)芽以及根的伸長，對于不同植物，污染物的毒性效應(yīng)也有區(qū)別.本試驗選取PAHs中熒蒽及苯并（b）熒蒽這2種物質(zhì)對蘋果砧木-平邑甜茶幼苗進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)受脅迫后的平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞表面Ca2+、K+、H+流動性相比正常環(huán)境中發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)，Ca2+、K+表現(xiàn)為外排趨勢，H+表現(xiàn)較穩(wěn)定的內(nèi)吸趨勢.說明PAHs的存在嚴(yán)重干擾植物的正常生長，破壞了植物對礦質(zhì)元素的吸收.

平邑甜茶幼苗在受到PAHs脅迫后，根毛細(xì)胞表面Ca2+外排.導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是根毛細(xì)胞受外來PAHs刺激后，胞質(zhì)Ca2+濃度出現(xiàn)短暫上升，從而激起細(xì)胞應(yīng)答，做出相應(yīng)調(diào)節(jié)反應(yīng).Ca2+泵和Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，跨膜釋放胞質(zhì)Ca2+到胞外及胞內(nèi)“鈣庫”，以維持Ca2+濃度穩(wěn)態(tài)［27-28］.Ca2+是維持植物細(xì)胞正常生理功能的重要離子，參與大多數(shù)細(xì)胞生理代謝過程，在穩(wěn)定植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外離子濃度平衡、誘導(dǎo)細(xì)胞抗逆基因表達(dá)中起重要作用［29-31］.平邑甜茶受到熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后，體內(nèi)Ca2+會大量外排，細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性、功能穩(wěn)定性被破壞，不利于鈣的儲藏及吸收，影響平邑甜茶的正常生長發(fā)育.

受外源PAHs脅迫，平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞K+流動性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為外排趨勢.與顧閩峰等通過對結(jié)球甘藍(lán)幼苗根進(jìn)行鹽脅迫，導(dǎo)致K+含量下降結(jié)果相似［32］.導(dǎo)致這種結(jié)果可能是由于PAHs對根毛細(xì)胞膜造成損傷，致使根毛喪失選擇性吸收離子的功能.細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致K+外流［33-35］.此外，根毛細(xì)胞受PAHs脅迫會導(dǎo)致更多活性氧的產(chǎn)生，從而發(fā)生氧化脅迫，細(xì)胞膜通透性改變，內(nèi)部電解質(zhì)外滲，K+外排，引起細(xì)胞死亡［36］.此外，根毛細(xì)胞膜電勢的去極化也會造成K+外排［37］.K+是植物生長發(fā)育中必需的大量元素，對調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，維持細(xì)胞電荷平衡、酶活性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長、氣孔開閉、細(xì)胞極性以及葉片運(yùn)動都有著重要意義［38］.K+外流，植物生長所需的營養(yǎng)元素得不到補(bǔ)充，營養(yǎng)失調(diào)，生長受到抑制，甚至死亡.

待測幼苗根部H+受PAHs脅迫后，表現(xiàn)為內(nèi)吸趨勢.原因可能是Ca2+-ATPase、Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體受熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后被活化，同時H+-ATPase水解ATP產(chǎn)生能量，將H+從細(xì)胞質(zhì)中泵出，產(chǎn)生跨質(zhì)膜H+電化學(xué)勢梯度，驅(qū)動質(zhì)膜Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行離子轉(zhuǎn)運(yùn)：H+順著電化學(xué)勢梯度進(jìn)入細(xì)胞，Ca2+逆著電化學(xué)勢梯度排出細(xì)胞.同時平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞由于受PAHs脅迫導(dǎo)致膜電勢去極化，外向K+通道被激活，介導(dǎo)K+向細(xì)胞膜外流動，促進(jìn)K+的釋放，由此產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)外電化學(xué)勢梯度，在H+/K+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體作用下，胞外H+進(jìn)入細(xì)胞，K+排出細(xì)胞［39］.H+參與光合作用等植物生理活動，PAHs脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H+穩(wěn)態(tài)失衡，對平邑甜茶光合作用等一系列生理活動造成不利影響，影響其正常生長.

熒蒽及苯并（b）熒蒽這兩種物質(zhì)對根系細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性、穩(wěn)定性的破壞，及其吸收轉(zhuǎn)運(yùn)等毒性機(jī)理有待于進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

4.1 受熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫，根毛細(xì)胞表面Ca2+、K+、H+流動性發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)，Ca2+、K+表現(xiàn)為外排趨勢，且外排量逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定；H+表現(xiàn)較穩(wěn)定的內(nèi)吸趨勢.

4.2 苯并（b）熒蒽脅迫對平邑甜茶幼苗根毛細(xì)胞表面Ca2+、K+、H+流動性造成的毒害效應(yīng)高于熒蒽.

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致謝：文章中的英語寫作部分，謝興斌老師給予了很大幫助，在此表示感謝.

The ion mobility in root hair cells of Malus hupehensis in response to stress from PAHs.

XU Jin， HUANG Cui-xiang，LiU Qing， MAO Yun-fei， NI Wei， YU Wen-zhang， SHEN Xiang （College of Horticultural Science and Engineering，Shandong Agricultural University， State Key Laboratory for Crop Biology， Taian 271018， China）. China Environmental Science， 2016，36（10）：3107～3111

Apple stock-Pingyitiancha （Malus hupehensis Rehd） was selected as experimental materials， hydroponic experiments were conducted with or without fluoranthene and benzo （b） fluoranthene. Non-invasive Micro-test Technique was used to detect the effects of Ca2+， K+， H+fluxes in response to polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） treatments. Our results showed that: （1） fluoranthene and benzo （b） fluoranthene treatments resulted in the liquidity of Ca2+increased from（-63.53±9.30）pmol/（cm2·s） to （+62.85±10.00）pmol/（cm2·s）、（91.33±19.72） pmol/（cm2·s）； the liquidity of K+increased from（-60.56±14.56）pmol/（cm2·s） to（+32.60±5.44）pmol/（cm2·s）、（+36.76±5.23）pmol/（cm2·s）； the liquidity of H+reduced from（+44.38±5.19）pmol/（cm2·s） to（-0.72±0.055）pmol/（cm2·s）、（-6.34±0.79）pmol/（cm2·s）. fluoranthene and benzo （b）fluoranthene treatments resulted in the liquidity of Ca2+， K+， H+in root epidermis obvious reversal. A dramatic Ca2+， K+efflux was observed in root epidermis under stress， and gradually reduced to a stable level. Meanwhile， H+showed influx and did not affect the PAHs treatments. （2） Benzo［b］fluoranthene Stress showed more toxic effects on ion mobility in root hair cells than that of fluoranthene. The results indicated that PAHs stress could damage the ion mobility of root hair cells，interfere plants growth and development， providing a theoretical basis for further study on the response of plants to PAHs stress.

Malus hupehensis Rehd；fluoranthene；benzo［b］fluoranthene；stress；the ion mobility

X173

A

1000-6923（2016）10-3107-05

徐 金（1992-），女，山西運(yùn)城人，在讀碩士研究生，主要從事果樹生理學(xué)方向研究.

2016-02-29

山東省果品創(chuàng)新團(tuán)隊（SDAⅠT-06-07）；支撐計劃專項（2014BAD16B02）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-28）；公益性行業(yè)科技專項（201303093）

* 責(zé)任作者， 教授， guanshanghaitang@126.com