常晨，梁敏，包怡紅*

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040）

漆酶及其在釀酒工業(yè)中的應用研究進展

常晨，梁敏，包怡紅*

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040）

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在造紙、生物漂白和食品等領(lǐng)域得到了廣泛研究與應用。該文綜述了漆酶的來源與分布、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及其在釀酒工業(yè)的應用研究進展，包括在保持啤酒穩(wěn)定性、葡萄酒澄清、測定葡萄酒中某些化合物和作為葡萄孢灰霉感染指示劑等方面，并展望了漆酶在釀酒工業(yè)的發(fā)展前景。

漆酶；釀酒工業(yè)；應用；研究進展

漆酶（laccase）EC 1.103.2又稱苯二醇；氧化還原酶（ρ-diphenol：oxygen oxidoreductase）是一種含銅的多酚氧化酶（polyphenoloxidases，PPO），和植物中的抗壞血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase）、哺乳動物的血漿銅藍蛋白（ceruloplasmin）同屬藍色多銅氧化酶（blue multi-copper oxidase）家族[1]。

1 漆酶的來源和分布

漆酶按其來源主要分為漆樹漆酶（rhus laccase）、真菌漆酶（fungal laccase）、細菌漆酶（bacterial laccase）和動物源漆酶[2]。1883年，YOSHIDA在漆樹（Rhus vernicifera）中發(fā)現(xiàn)漆酶，后來在真菌中也檢測到漆酶的存在。真菌漆酶來源廣泛，產(chǎn)漆酶的真菌絕大多數(shù)為擔子菌亞門（Basidiomycotina），約占80%，尤其是一些可以在自身生長過程中通過氧化和水解等作用降解天然木質(zhì)素的白腐真菌，包括變色栓菌、木耳、香菇、云芝、糙皮側(cè)耳等，其次是子囊菌亞門（Ascomycotina）（約占15%），極小部分為半知菌亞門（Deuteromycotina）和其他低等真菌（約占4%）[3-5]。1993年，AUDAN A等[6]在稻田土壤中發(fā)現(xiàn)分泌漆酶的細菌，經(jīng)鑒定為脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum），ALEXANDRE G等[7]運用生物信息學技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)漆酶在原核生物中分布也較為廣泛。除此之外，在少數(shù)昆蟲（家蠶、果蠅、綠蠅、蒼蠅、伏蠅）及一些動物內(nèi)臟和血清中也發(fā)現(xiàn)了漆酶。不同來源的漆酶，作用、性質(zhì)也各不相同，如漆樹漆酶能夠催化木質(zhì)素聚合沉積，真菌漆酶能夠催化木質(zhì)素降解，而細菌漆酶在銅離子抗性和熱穩(wěn)定性等方面比真菌漆酶更具有優(yōu)勢[8-10]。

2 漆酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

不同來源的漆酶，在分子質(zhì)量、氨基酸組成、銅原子數(shù)及類型等方面均有差異，但是大部分漆酶都具有三個典型的結(jié)構(gòu)，即肽鏈、糖配基和銅原子[11]。真菌漆酶糖基化程度高，占酶分子的10%～49%，包括葡萄糖、半乳糖、氨基己糖、巖藻糖、阿拉伯糖等，糖基的組分和比例差異會產(chǎn)生同工酶，糖基也有利于漆酶結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，漆酶單體通常包含3～10個糖基化位點，細菌漆酶不需要糖基化的修飾。漆酶通常以單體蛋白體的形式存在，漆酶的分子質(zhì)量通常為60～80ku，酸性pH催化效率較高，適宜溫度低的環(huán)境[12-13]。大多數(shù)的漆酶為一條多肽鏈組成的單聚體，酶分子多肽鏈上大約含有500個氨基酸，主要含有19種氨基酸：Asp、Thr、Glu、Ser、Pro、Gly、Ala、Val、Cys、Met、Ile、Leu、Tyr、Gln、Phe、Lys、His、Arg、Trp[14]。

漆酶分子通常有4個銅原子，位于3個高度保守的不同結(jié)合位點，能催化O2通過4個電子還原成水，并氧化酚類和芳香類物質(zhì)脫去羥基上的電子或質(zhì)子，生成苯醌[15]。但也有特殊情況，如雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）分泌的酶分子只有2個銅原子，純化后的蛋白卵白為淡黃色，射脈側(cè)菌（Phlebia radiata）分泌的酶分子只含有2個銅原子，純化后的蛋白為白色，而含有2個銅原子的漆酶為藍色蛋白[16]。漆酶中的4個銅離子可分成三類：Ⅰ型Cu2＋和Ⅱ型Cu2＋各有一個，Ⅲ型Cu2＋兩個，Ⅰ型Cu2＋又稱藍色Cu2＋，Ⅱ型Cu2＋不呈藍色，Ⅰ型Cu2＋和Ⅱ型Cu2＋都是單電子受體，具有電子順磁共振效應（electronparamagnetic resonance，EPR），Ⅲ型Cu2＋是雙電子受體，不具有EPR性質(zhì)[17]。

影響漆酶活性的因素包括溫度、pH和金屬離子等。漆酶的最適反應溫度在25～85℃之間，大部分漆酶在50～60℃仍能保持穩(wěn)定，不同來源的漆酶及其反應底物的不同會造成最適溫度的不同。漆酶的最適pH范圍為4～6，酸性pH時漆酶的催化活性更高。有些金屬離子能夠促進酶促反應，如銅離子；而有些金屬離子卻能夠抑制酶促反應，如銅離子螯合劑。

3 漆酶在釀酒工業(yè)中的應用

啤酒和葡萄酒中含有多酚類物質(zhì)，多酚不利于酒的穩(wěn)定性，應盡可能除去[18]，漆酶可以氧化多酚物質(zhì)，防止酒產(chǎn)生渾濁，進而改善酒的感官品質(zhì)、延長保質(zhì)期。

3.1 在保持啤酒性穩(wěn)定性中的應用

透明度是衡量啤酒質(zhì)量的標準之一，啤酒在灌裝時呈澄清狀態(tài)，在貯存過程中會產(chǎn)生渾濁，原因是貯藏時多酚與蛋白質(zhì)復合產(chǎn)生大分子的多酚-蛋白質(zhì)復合物，其中影響穩(wěn)定性的多酚類物質(zhì)主要是花色素原和聚合單寧[19]。聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）可以與啤酒中的多酚物質(zhì)形成不溶的絡(luò)合物，但后續(xù)除去聚乙烯聚吡咯烷酮工藝較復雜。因此，采用漆酶是種較好的新方法。

用漆酶預先處理麥汁，可除去其中的多酚物質(zhì)，減少了與蛋白質(zhì)結(jié)合的前體物質(zhì)，提高了啤酒的質(zhì)量與清亮程度。PETERSENBR等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在啤酒中加入適量漆酶，可以有效去除殘留的O2，提高了啤酒的穩(wěn)定性，漆酶和多酚反應產(chǎn)生的復合物可以采用離心等方法除去。ROSSI M等[21]研究發(fā)現(xiàn)，漆酶在啤酒的穩(wěn)定性方面有重要作用。

3.2 在葡萄酒澄清中的應用

葡萄中含有的營養(yǎng)成分包括糖、花色素、多酚、有機酸、維生素等，葡萄酒是以葡萄為原料發(fā)酵而成的飲品，既保留了葡萄的營養(yǎng)成分，又在釀造過程中產(chǎn)生了新的營養(yǎng)成分，如醇類、酯類、酵母自溶物等[22-23]。葡萄酒中含有大量的酚類化合物，如單寧、花色苷、酚酸和黃酮醇等，酚類物質(zhì)嚴重影響了葡萄酒的風味、顏色和穩(wěn)定性[24]。

葡萄酒渾濁的主要原因包括蛋白質(zhì)類渾濁、果膠類渾濁[25]。其中蛋白質(zhì)類渾濁是由于蛋白質(zhì)與葡萄酒中的單寧等多酚類物質(zhì)復合形成不溶性復合物，導致葡萄酒變渾。生產(chǎn)中常通過添加PVPP、二氧化硫等除去多酚類物質(zhì)[26-27]。但上述添加劑可能會降低酒的感官品質(zhì)，有些還難以分解，造成環(huán)境污染。而漆酶可以氧化多酚類化合物，二者結(jié)合后，采用離心等方法除去。

CZYZOWSKA A等[28]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒長時間儲存后，多酚類物質(zhì)的含量會減少，進而改變葡萄酒的色澤。CANTARELLI C等[29]研究發(fā)現(xiàn)，來自Polyporus versicolor的漆酶可以清除樣品中70%的兒茶酚、90%的阿魏酸和90%的花色素，黑色葡萄汁經(jīng)過漆酶的處理可清除50%的總多酚，通過和常規(guī)澄清方法對比，實驗結(jié)果顯示先用漆酶，再用硅藻土溶液或者聚乙烯吡咯烷酮處理葡萄酒溶液，更能有效提高葡萄酒的穩(wěn)定性與感官品質(zhì)，通過對比漆酶、酚酶、單寧酸酶和花色苷酶處理葡萄酒的效果，結(jié)果表明漆酶對酚類物質(zhì)的清除率最高。MINUSSI R C等[30]采用來自Trametes versicolor的漆酶分別處理紅葡萄酒和白葡萄酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)漆酶會清除紅葡萄酒中具有抗氧化活性的多酚類化合物，而對白葡萄酒處理時，總酚類物質(zhì)的減少對品質(zhì)的有利作用高于抗氧化特性對品質(zhì)的有利影響，因此可以用漆酶處理白葡萄酒。CONRAD L S等[31]采用酚氧化酶處理軟木，優(yōu)選的酚氧化酶是漆酶、過氧化物酶、兒茶酚氧化酶、鄰氨基苯酚氧化酶，酚氧化酶的處理減輕了瓶裝葡萄酒的特征性軟木澀味。

目前，漆酶通常以固定化形式在葡萄酒的釀造中應用，但是必須保證它最終從葡萄酒中除去。

3.3 測定葡萄酒中的化學成分

CHAWLA S等[32]通過將漆酶以共價鍵形式固定化在金電極上的銀納米粒子（Ag nanoparticle，AgNP）/氧化鋅納米粒子（Zn nanoparticle，ZnONP）的納米復合材料上，構(gòu)建了一種采用高度敏感電流型生物傳感器測量葡萄酒中總酚含量的方法，具有工作電位低（0.22 V），響應時間短（8 s），靈敏度高，和儲存穩(wěn)定性高（5個月）的優(yōu)點。GAROIAGUZMHNJ J等[33]將漆酶生物傳感器用于葡萄酒中酚類的選擇性測定，主要響應鄰二酚，通過對14種紅葡萄酒和白葡萄酒進行取樣，并對其進行生物傳感器多酚指數(shù)（biosensor polyphenol index，I-BP）與二氧化硫（SO2）濃度的比率分析，以此來判斷葡萄酒的營養(yǎng)價值。GODOY-NAVAJAS J等[34]研究發(fā)現(xiàn)了一種漆酶、氧化鋱納米顆粒（Tb4O7nanoparticles，Tb4O7NPs）和8-羥基苯乙烯-3-磺酸鹽三鈉（8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonicacid，trisodiumsalt，HPTS）結(jié)合的傳感器，能夠有效自動測定葡萄酒中多酚的含量，將該方法應用于幾種葡萄酒樣品的分析，獲得了80.0%～108.3%的回收率。WANG Y等[35]建立了以咖啡酸和沒食子酸為標準物的漆酶生物傳感器，并分別對紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒中的多酚物質(zhì)含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)三種葡萄酒中的多酚物質(zhì)含量從大到小依次為紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒，且咖啡酸比沒食子酸表現(xiàn)出更高的靈敏度，通過漆酶生物傳感器測定的總抗氧化活性與生物電化學多酚指數(shù)的線性關(guān)系可以計算葡萄酒的Trolox當量抗氧化能力（trolox-equivalent antioxidant capacity assay，TEAC）。但目前漆酶生物傳感器穩(wěn)定性較差、壽命較短，高效漆酶固定方法的使用、高催化性能材料的開發(fā)以及與微電子技術(shù)的聯(lián)用將會使漆酶生物傳感器在食品檢測方面發(fā)揮更重要的作用。

3.4 作為葡萄汁中灰葡萄孢感染的指示劑

灰葡萄孢（Botrytiscinerea）分泌的漆酶能使葡萄腐爛，若葡萄被灰葡萄孢真菌感染，則在葡萄酒中會檢測到漆酶的活性[36]。但MACHEIX J J等[37]研究發(fā)現(xiàn)，漆酶只能作為定性指示劑，暫時還不能定量分析出葡萄的受污染程度。在葡萄酒中檢測出漆酶活性也只能確定葡萄被灰葡萄孢菌感染，而葡萄酒中漆酶的酶活與葡萄受污染程度還沒找到比例關(guān)系，通過葡萄酒中漆酶的活力推測出灰葡萄孢菌感染程度對葡萄酒品質(zhì)的控制以及其他食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究將具有不可忽視的作用。

4 展望

本文綜述了漆酶的來源與分布、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及其在釀酒工業(yè)的應用研究進展，包括在保持啤酒穩(wěn)定性、葡萄酒澄清、測定葡萄酒中某些化合物、作為葡萄孢灰霉感染指示劑等方面。漆酶來源廣泛，應用范圍廣，反應條件溫和，無毒副產(chǎn)物。然而，目前有關(guān)漆酶的研究仍存在以下問題：漆酶在原始微生物中含量低，生產(chǎn)成本較高，工業(yè)產(chǎn)量低，尚不能進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[38]；此外天然漆酶的部分性質(zhì)不適合工業(yè)上實際生產(chǎn)的需要，如最適溫度、pH等；漆酶的分子結(jié)構(gòu)、催化機理、異源表達和分子調(diào)控等方面有待深入研究。

今后對漆酶的深入研究，可以從以下幾個方面進行：第一，篩選高產(chǎn)漆酶的菌株，采用生物學技術(shù)克隆酶學性質(zhì)優(yōu)良的新型漆酶基因，并對其進行異源高效表達和蛋白質(zhì)工程改造；第二，探索適宜的培養(yǎng)條件，降低工業(yè)生產(chǎn)價格，增加漆酶產(chǎn)量；第三，優(yōu)化漆酶的固定化方法，尋求或構(gòu)建某種合適的固定化載體，增強漆酶的穩(wěn)定性和使用效果；第四，拓展漆酶的應用范圍以及技術(shù)參數(shù)和效果分析。隨著人們對漆酶的研究進一步深入，相信在不久的將來，漆酶在釀酒工業(yè)中的應用前景會越來越廣闊。

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Research progress and application of laccase in alcoholic drink industry

CHANG Chen,LIANG Min,BAO Yihong*
(College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase,being widely researched and used in papermaking,biological bleaching,food industry and other areas.The source and distribution,structure and property of laccase and research progress of its application in alcoholic drink industry were summarized,including the stability of beer,the clarification of wine,the determination of certain compounds in wine,as the indicator ofBotrytis cinereainfection,and the development prospect of laccase in the alcoholic drink industry was prospected.

laccase;alcoholic drink industry;applications;research progress

Q554

0254-5071（2017）07-0018-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.005

2017-04-19

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（2572016CG02）；東北林業(yè)大學博士研究生自主創(chuàng)新基金項目（2572017AA02）

常晨（1994-），女，博士研究生，研究方向為林下資源精深加工，功能性食品。

*通訊作者：包怡紅（1970-），女，教授，博士，研究方向為林下資源精深加工，功能性食品。