盧 娜， 魏林郁， 王寶英， 李 璐， 楊坤麗， 李東亮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

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雷帕霉素減輕氧糖剝奪對SH-SY5Y細胞的損傷*

盧 娜△， 魏林郁， 王寶英， 李 璐， 楊坤麗， 李東亮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的： 觀察雷帕霉素(Rapa)對氧糖剝奪(OGD)的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的影響，并探討自噬在其中的作用。方法: SH-SY5Y細胞隨機分為4組: 正常對照組(常規(guī)培養(yǎng)，不進行OGD處理)、Rapa組、OGD組(無糖培養(yǎng)基、1% O2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)孵育細胞12 h)和Rapa+OGD組。進行形態(tài)學觀察;MTT法檢測細胞活力；乳酸脫氫酶(LDH)漏出率判斷細胞損傷的程度；caspase-3 活性檢測試劑盒檢測酶活性；原位末端標記(TUNEL)法檢測凋亡水平；Western blot法檢測凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2、自噬標志蛋白LC3B-Ⅱ及自噬調(diào)控蛋白beclin-1的表達。結果: 與OGD組相比，Rapa+OGD組的細胞存活率明顯升高(P<0.05)，LDH 漏出率及caspase-3酶活性明顯降低(P<0.05)。TUNEL染色觀察結果顯示，與OGD組相比，Rapa+OGD組的細胞凋亡明顯減少(P<0.05)；Western blot實驗結果顯示Rapa+OGD組的Bcl-2、beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白的表達水平顯著高于OGD組(P<0.05)，而Bax蛋白水平明顯低于OGD 組(P<0.05)。 結論: Rapa對OGD 損傷的SH-SY5Y細胞具有保護作用，其機制可能與上調(diào)beclin-1蛋白、激活自噬有關。

雷帕霉素； SH-SY5Y細胞； 氧糖剝奪； 自噬

神經(jīng)細胞的氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型近年來多被用于在細胞水平模擬臨床腦卒中過程，并主要以氧糖剝奪后快速恢復氧糖供應，從而模擬腦缺血再灌注損傷進行細胞自主修復及藥物研究[1]。雷帕霉素(rapamycin，Rapa)不僅是一種免疫抑制劑，同時也是一種自噬反應增強劑[2]。近年來，來自人類和動物模型的大量研究均顯示，細胞自噬與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進展及預后密切相關[3-5]。本研究擬以SH-SY5Y細胞為對象，通過建立氧糖剝奪模型來模擬卒中的局部腦梗死過程，并進一步研究Rapa對于SH-SY5Y 細胞損傷的影響，對進一步探討自噬對缺血缺氧過程中神經(jīng)元的保護機制, 探索新的治療靶點具有重要意義。

材 料 和 方 法

1 材料及主要儀器

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株由上海中科院典型細胞培養(yǎng)庫提供；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購于HyClone；MTT細胞活力及細胞毒性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒、caspase-3活性檢測試劑盒和一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術公司；鼠抗Bcl-2和Bax單克隆抗體及兔抗beclin-1、LC3B-Ⅱ多克隆抗體購自Abcam；蛋白Marker購自碧云天生物技術公司；Rapa購自Gene Operation。三氣培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific；IX71熒光顯微鏡購自Olympus。

2 方法

2.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)及分組 細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM中，在37 ℃、含體積分數(shù)為5% CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液，當單層細胞融合后，行傳代處理。傳代后隨機分為對照(control)組、Rapa組、OGD組和Rapa+OGD組。每次每組設6 個平行復孔，實驗重復3 次。

2.2 SH-SY5Y細胞OGD模型的建立 OGD模型制備參照文獻[1, 6-8]并進行改良。選用生長良好的SH-SY5Y細胞，置換成無糖無血清培養(yǎng)基孵育，放入37 ℃三氣培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2和94% N2)中培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h和24 h，以選擇最佳作用時間。

2.3 Rapa工作液的配置 取5 mg Rapa粉末，置于滅菌EP管中，加入100 μL無水乙醇充分溶解，加至100 mL DMEM完全培養(yǎng)基，充分混勻，即為50 mg/L Rapa工作液。

2.4 形態(tài)學觀察 SH-SY5Y細胞分別進行不同處理后，置于Olympus CKX41倒置相差顯微鏡上觀察各組細胞形態(tài)特征，隨機選擇視野拍照。

2.5 MTT比色法檢測細胞存活率 將細胞以5×107/L密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，24 h后處理細胞。作用完畢后每孔加入MTT(5.0 g/L)10 μL、置入培養(yǎng)箱孵育4 h后，每孔再加入100 μL Formanzan溶解液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育4 h。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm測定各孔吸光度(absorbance，A)，評價細胞存活率。SH-SY5Y存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。本實驗對照組的細胞存活率定為100.0%。

2.6 LDH釋放檢測 根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)孔板中，細胞密度約70%～80%。處理完畢后，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400×g離心5 min。取上清120 μL，移入新的96孔板相應孔中，各孔再加入60 μL LDH檢測工作液，混勻，室溫(約25℃)避光孵育30 min(用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動)。然后在490 nm處測定吸光度。選用600 nm作為參考波長進行雙波長測定。LDH活力=(處理樣品吸光度-背景空白對照孔吸光度)/(標準管吸光度-標準空白管吸光度)×標準品濃度。

2.7 Caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3酶活性 冰浴裂解細胞15 min，4 ℃、20 000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到96孔板中。配置反應體系，再加入Ac-DEVD-pNA反應底物后混勻，37 ℃孵育60 min，測定A405。通過標準曲線對比計算出樣品中催化產(chǎn)生多少量的黃色的對硝基苯胺(p-nitroaniline, pNA)，反映caspase-3的活性。

2.8 一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，以2×105/L、每孔500 μL細胞懸液接種于24孔板內(nèi)的載玻片上。培養(yǎng)24 h后，分組處理細胞；棄培養(yǎng)液、PBS洗滌1次、4%多聚甲醛固定1 h、0.1% Triton X-100冰浴孵育5 min、在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，封片后立即在熒光顯微鏡下觀察。在100倍鏡下，隨機取5個視野，計數(shù)呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細胞，取平均值，計算細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/視野下細胞總數(shù)×100%。實驗重復3 次。

2.9 Western blot法檢測蛋白表達 收獲細胞，4 ℃預冷的PBS洗1次，加入適量的細胞裂解液，用細胞刮子刮下細胞，低溫離心機12 000 ×g離心10 min，取上清液，棄沉淀。用BCA法測定各組蛋白含量，每孔上樣25 μL蛋白，經(jīng)15% SDS-PAGE 80 V電泳2 h后，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，5% 脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，在 4 ℃ 孵育Ⅰ抗(鼠抗人Bcl-2及Bax稀釋比例為1∶2 000,兔抗人beclin-1及LC3B-II稀釋比例為1∶3 000)；5%脫脂牛奶常溫下封閉Ⅱ抗(羊抗兔辣根過氧化物酶IgG 和羊抗小鼠辣根過氧化物酶IgG 稀釋比例為 1∶5 000，5% 脫脂牛奶配制)，ECL 顯影顯示目的條帶和內(nèi)參照，用ImageJ軟件分析吸光度值，代表蛋白表達的相對水平。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同OGD處理時間對SH-SY5Y細胞存活率的影響

MTT法檢測結果以OGD處理0 h組細胞存活率為100.0%，則OGD處理3 h、6 h、9 h、12 h和24 h組存活率分別為96.2%、84.8%、74.5%、52.3%和26.8%；與0 h組比較,6 h、9 h、12 h和24 h組的存活率均顯著降低(P<0.05)，見圖1。后續(xù)實驗采用OGD處理12 h建立模型。

Figure 1.The effect of treatment with OGD for different time periods on the viability of SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖1 不同OGD處理時間對SH-SY5Y細胞存活率的影響

2 不同濃度Rapa處理組SH-SY5Y細胞形態(tài)的觀察

倒置相差光學顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞形態(tài)的變化，正常SH-SY5Y 細胞大部分呈梭形、三角形，少數(shù)呈多邊形，胞漿飽滿，多數(shù)可見細胞突起，折光性好，貼壁能力強；Rapa處理后，隨著濃度增加，細胞貼壁數(shù)量明顯減少，細胞形態(tài)不規(guī)則，體積皺縮，突起減少或消失，折光性減弱，脫壁的細胞增加，見圖2。

Figure 2.The effect of Rapa at different concentrations on the morphological changes of SH-SY5Y cells (×100).

圖2 不同濃度Rapa對SH-SY5Y 細胞形態(tài)的影響

3 Rapa作用的最適濃度選擇

MTT法檢測結果以空白對照組細胞存活率為100.0%，則50、40、30、20、10和5 mg/L Rapa作用24 h的存活率分別為28.7%、34.2%、40.5%、54.3%、97.1%和98.2%；后2個濃度Rapa組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，見圖3。 后續(xù)實驗選擇10 mg/L為Rapa作用的最適濃度。

4 不同處理因素對SH-SY5Y 細胞形態(tài)的影響

倒置相差光學顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞形態(tài)的變化，可見正常SH-SY5Y 細胞大部分呈梭形、三角形，少數(shù)呈多邊形，胞漿飽滿，多數(shù)可見細胞突起，折光性好，貼壁能力強；OGD處理后，細胞貼壁數(shù)量明顯減少，細胞形態(tài)不規(guī)則，體積皺縮，突起減少或消失，折光性減弱，脫壁的細胞增加；Rapa+OGD組細胞的缺氧缺糖損傷明顯減輕，提示自噬激動劑Rapa能減輕 OGD引起的細胞損傷，見圖4。

Figure 3.Effect of different concentrations of Rapa on the viabi-lity of SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 不同濃度Rapa對SH-SY5Y 細胞存活率的影響

5 不同處理因素對SH-SY5Y細胞存活率的影響

MTT法檢測結果以空白對照組細胞存活率為100.0%，則Rapa、OGD和Rapa+OGD組存活率分別為98.6%、53.8%和79.5%；OGD和Rapa+OGD組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；OGD組與Rapa+OGD組比較差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見表1。

Figure 4.The effect of different treatment factors on the morphological changes of SH-SY5Y cells (×100).

圖4 不同處理因素對SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

6 不同處理因素對SH-SY5Y細胞培養(yǎng)上清液中LDH漏出量的影響

LDH釋放是細胞膜完整性的重要指標， LDH活性檢測結果顯示OGD組和Rapa+OGD組培養(yǎng)上清液中的LDH活性明顯高于正常對照組(P<0.05)；Rapa+OGD 組的LDH活性明顯低于OGD組(P<0.05)，見表1。

表1 Rapa對氧糖剝奪損傷 SH-SY5Y細胞的存活率和LDH漏出量的影響
Table 1.The effects of Rapa on the viability and leakage of LDH in the SH-SY5Y cells injured by OGD (Mean±SD.n=3)

GroupCellviability(%)LDH(U/L)Control100．0±0．066．2±5．8Rapa98．6±2．370．6±5．5OGD53．8±2．5?803．3±5．4?Rapa+OGD79．5±2．7#708．7±5．6#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

7 不同處理因素對SH-SY5Y細胞caspase-3酶活性的影響

Caspase-3活性檢測試劑盒檢測結果以空白對照組細胞的caspase-3酶活性為1，則Rapa、OGD和Rapa+OGD組的caspase-3酶活性分別為1.08、3.16和2.63。OGD組和Rapa+OGD組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；Rapa+OGD組與OGD組比較差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The caspase-3 activity in the SH-SY5Y cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

圖5 各組細胞caspase-3酶活性的比較

8 TUNEL法熒光染色檢測細胞凋亡率

TUNEL 熒光染色可見control組和Rapa組陽性凋亡細胞數(shù)較少； OGD組和Rapa+OGD組陽性細胞數(shù)明顯增多,Rapa+OGD組明顯低于OGD組(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The TUNEL staining and apoptotic rate in the SH-SY5Y cells with different treatments (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

圖 6 各組細胞的TUNEL熒光染色及凋亡率比較

9 Western blot法檢測 Bcl-2、Bax、beclin-1和LC3B-Ⅱ蛋白水平的變化

Western blot分析結果顯示，與正常對照組比較，OGD組和Rapa+OGD組的Bax蛋白表達量均明顯增加(P<0.05)；而Bcl-2表達明顯減低(P<0.05)。Rapa+OGD組Bax蛋白表達明顯低于OGD組(P<0.05)；Rapa+OGD組的Bcl-2蛋白表達明顯高于OGD組(P<0.05)。與正常對照組比較，Rapa組和Rapa+OGD組的beclin-1和LC3B-Ⅱ蛋白表達量均明顯增加(P<0.05)；且Rapa+OGD組beclin-1和LC3B-Ⅱ蛋白表達明顯高于OGD組(P<0.05)，見圖7。

Figure 7.The protein levels of Bcl-2, Bax, beclin-1 and LC3B-Ⅱ in the SH-SY5Y cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

圖7 各組SH-SY5Y細胞Bcl-2、Bax、beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白水平的比較

討 論

自噬是指細胞在自噬相關基因(autophagy-rela-ted gene，Atg)的調(diào)控下，清除細胞內(nèi)少量受損的細胞器(如線粒體等)和生物大分子(如蛋白質(zhì)等)，維持細胞內(nèi)環(huán)境自身穩(wěn)定的一種溶酶體依賴的降解途徑[9]。自噬廣泛存在于真核細胞中，參與了如神經(jīng)退行性改變、精神分裂、腦損傷等多種疾病的發(fā)病過程[10]。目前，大多數(shù)研究證實自噬具有腦保護作用[11-12]，提示一定程度自噬的增強對維持神經(jīng)細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定意義重大。自噬過程包括自噬的誘導；自噬體組裝成形；自噬體的運輸、與溶酶體融合；自噬體的降解。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3/Atg8)即是自噬體膜上的標記蛋白。LC3 蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成 LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ散在分布于細胞漿內(nèi)。當自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)偶聯(lián)形成 LC3-Ⅱ，并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，而且LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標記，且 LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[13]。Beclin-1是自噬過程中一個重要的正性調(diào)節(jié)因子。哺乳動物自噬基因beclin-1是酵母apg6/vps30基因的同源物。Beclin-1 對自噬的調(diào)節(jié)不是孤立的，相反，它能與多種分子相互作用，形成不同復合體而發(fā)揮作用。Beclin-1既可以與Bcl-2、Bcl-xL結合調(diào)控凋亡，又與PI3KC3形成復合物在自噬過程中發(fā)揮關鍵作用，是凋亡與自噬途徑相互交流和協(xié)調(diào)的重要蛋白質(zhì)[14]。

雷帕霉素是一類新型免疫抑制劑，它通過抑制mTOR的蛋白激酶活性發(fā)揮作用。在很多哺乳動物細胞證實具有自噬誘導效應[15]，如人類乳腺癌細胞、 肺癌細胞、角質(zhì)細胞瘤細胞等。目前研究發(fā)現(xiàn)，Rapa通過激活自噬系統(tǒng)，減少大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元凋亡[16]；Rapa干預自噬可減輕高糖對系膜細胞的氧化損傷[17]；Rapa能夠增強自噬,減少足細胞凋亡[18],提示Rapa可增強自噬,具有細胞保護作用。本研究擬以SH-SY5Y細胞為對象，通過建立氧糖剝奪模型來研究Rapa對于SH-SY5Y 細胞損傷的影響，進一步探討自噬在神經(jīng)元缺血缺氧過程中的作用， 探索新的治療靶點。

本研究結果提示OGD對SH-SY5Y細胞存活率的影響存在時間依賴性，選取OGD處理12 h為合適細胞模型；Rapa對SH-SY5Y細胞存活率存在劑量依賴性，高濃度Rapa明顯降低細胞存活率，選擇10 mg/L Rapa為最適作用濃度，進行后續(xù)實驗；Rapa明顯增加OGD導致的SH-SY5Y細胞存活率，降低了LDH漏出量，明顯降低OGD導致的SH-SY5Y細胞caspase-3酶活性的升高，明顯降低了OGD導致的SH-SY5Y細胞凋亡率，提示Rapa對神經(jīng)細胞缺氧缺血具有保護作用，與相關研究結果基本相符[19-21]。進一步通過Western blot法對凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及自噬相關蛋白LC3、beclin-1的表達進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)Rapa+OGD組Bax蛋白表達量明顯低于OGD組；而Bcl-2、LC3B-Ⅱ、beclin-1蛋白表達明顯高于OGD組。提示Rapa提高OGD損傷耐受性的機制可能與上調(diào)beclin-1、維持Bcl-2表達、抑制Bax表達從而減少細胞凋亡有關。因此, 我們推測Rapa通過上調(diào)beclin-1來誘導細胞自噬[22]，自噬的激活為細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，可對抗神經(jīng)元的氧糖剝奪損傷；自噬與凋亡存在負相關，對細胞的存活起一定的保護作用。

自噬是細胞內(nèi)的一種“自食(Self-eating)”現(xiàn)象，凋亡是“自殺(self-killing)”現(xiàn)象。兩者之間存在復雜聯(lián)系，在一定條件下自噬是細胞對應激的適應性反應，可避免發(fā)生死亡；而在其它環(huán)境中，自噬可能是細胞死亡的替代途徑。 Bcl-2家族成員在細胞凋亡與自噬過程中發(fā)揮著交叉性作用。Beclin-1有1個 BH3 結構域，Bcl-2、Bcl-xL 等可以通過這個BH3結構域與 beclin-1 結合而影響其活性?？沟蛲?Bcl-2家族蛋白和 beclin-1的表達水平、磷酸化、分子的亞細胞定位以及BH3-only 蛋白等，均可調(diào)節(jié) beclin-1 蛋白和 Bcl-2 家族蛋白結合水平，進而調(diào)控自噬的發(fā)生，并可能對細胞最終走向自噬還是凋亡起著關鍵作用[14]。自噬和凋亡有共用相同的刺激因素和調(diào)節(jié)蛋白，但是誘發(fā)閾值和門檻不同，如何轉(zhuǎn)換和協(xié)調(diào)目前還不清楚[23]。自噬在腦損傷中的作用仍需進行后續(xù)的探討來加以驗證，為腦缺血的防治開辟新的途徑。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Rapamycin reduces SH-SY5Y cell damage induced by oxygen-glucose deprivation

LU Na, WEI Lin-yu, WANG Bao-ying, LI Lu, YANG Kun-li, LI Dong-liang

(DepartmentofPhysiologyandNeurobiology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail: 13462225817@163.com)

AIM: To observe the effect of rapamycin (Rapa) on human neuroblastoma SH-SY5Y cell injury induced by oxygen-glucose deprivation (OGD), and to explore the role of autophagy in this process. METHODS: The SH-SY5Y cells were randomly divided into 4 groups: normal control group: the cells were cultured without OGD treatment; Rapa group: the cells were pretreated with Rapa for 1 h; OGD group: the culture medium was replaced by glucose-free medium and the cells were transferred to a humidified incubation chamber flushed by a gas mixture of 1% O2, 94% N2and 5% CO2for 12 h; Rapa+OGD group: the cultured cells were treated with Rapa for 1 h, and then were given the same treatments as those in OGD group. The cell viability was assessed by MTT assay. The degree of the cell damage was evaluated by determining the leakage of lactate dehydrogenase (LDH). The enzyme activity of caspase-3 was detected. TUNEL staining were used to detect the variation of cell apoptosis. The protein levels of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2, autophagy-related protein beclin-1 and autophagy marker protein LC3B were determined by Western blot. RESULTS: Compared with OGD group, the viability of the SH-SY5Y cells was significantly increased, and the activity of caspase-3 was significantly reduced in Rapa+OGD group (P<0.05). The SH-SY5Y cell injury was apparent after OGD with a great increase in the apoptotic rate (P<0.05). Compared with OGD group, the apoptotic rate significantly decreased in Rapa+OGD group (P<0.05). Compared with control group, the protein level of Bcl-2 was significantly decreased (P<0.05) and the protein level of Bax was significantly increased in OGD group. Compared with OGD group, the levels of Bcl-2, beclin-1 and LC3B-Ⅱ were significantly increased and the protein level of Bax was significantly increased in Rapa+OGD group (P<0.05). CONCLUSION: Rapamycin has a protective effect oninvitrocultured SH-SY5Y cells injured by OGD. The mechanism may be related to the promotion of autophagy．

Rapamycin; SH-SY5Y cells; Oxygen-glucose deprivation; Autophagy

1000- 4718(2017)01- 0104- 06

2016- 04- 08

2016- 11- 30

河南省教育廳科學技術重點研究項目(No. 14A310009；No. 14A310019)

R363.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.017

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