林 玲， 劉國良， 孫縵利

(漯河醫(yī)學高等?？茖W校，河南 漯河 462002)

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海馬CA1區(qū)5-HT1A受體調控PTSD大鼠空間記憶的作用*

林 玲△， 劉國良， 孫縵利

(漯河醫(yī)學高等?？茖W校，河南 漯河 462002)

目的： 觀察創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)大鼠海馬長時程增強(LTP)的變化以及5-羥色胺1A受體(5-HT1A受體)和突觸后致密物蛋白95(PSD-95)的表達，探討5-HT1A受體調控PTSD大鼠空間記憶的機制。方法: 健康成年SD大鼠36只，隨機分為正常對照組和模型組，每組18只。模型組采用連續(xù)單一刺激構建PTSD大鼠模型。Morris水迷宮實驗檢測2組大鼠的學習和記憶能力，電生理實驗檢測強直性高頻刺激對海馬LTP的影響，Western blot法和免疫熒光實驗檢測海馬5-HT1A受體和PSD-95蛋白的表達。結果: Morris水迷宮實驗結果顯示在各實驗日模型組大鼠逃避平臺的潛伏期較對照組顯著延長(P<0.05)。電生理實驗結果顯示在強直性高頻刺激后，2組大鼠海馬誘發(fā)電位的幅值明顯升高，模型組誘發(fā)電位的幅值顯著低于對照組(P<0.01)。Western blot實驗和免疫熒光實驗結果顯示，與對照組比較， 模型組大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A受體的表達顯著增加(P<0.05)，但PSD-95的表達明顯減少(P<0.05)。結論: PTSD大鼠空間記憶能力減退，可能與海馬CA1區(qū)5-HT1A受體的表達增加和PSD-95的表達減少有關。

創(chuàng)傷后應激障礙； 海馬； 5-HT1A受體； 突觸后致密物蛋白95； 學習和記憶

創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是指在受到異乎尋常的災難所致的心理創(chuàng)傷，引起的長期的持續(xù)性的精神障礙[1-2]，在臨床上以認知功能障礙為主要特征，意外事件部分遺忘或清晰記憶，接受及儲存新信息功能受損[3]。PTSD已經成為嚴重威脅人類健康甚至是生命的重要疾病之一，雖然廣受關注，但其發(fā)病機制目前并不十分清楚，研究表明，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)及其受體與焦慮、精神障礙、沖動行為、酒精依賴等精神疾病密切相關[4-5]。為了進一步揭示5-HT1A受體在PTSD發(fā)病過程中的作用，本實驗采用連續(xù)單一刺激(single prolonged stress，SPS)方法構建PTSD大鼠模型[6]，通過行為學方法檢測大鼠的學習和記憶能力、在體電生理記錄海馬生物電、Western blot實驗和免疫熒光實驗檢測海馬5-HT1A受體和突觸后致密物蛋白95 (postsynaptic density protein 95, PSD-95)的表達，探討5-HT1A受體調控PTSD大鼠空間記憶的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗動物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，SPF級，體質量180～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號為SCXK(湘)2011-0003。動物飼養(yǎng)在通風，自然光照環(huán)境，室溫維持在(22±1)℃。

1.2 試劑 兔抗5-HT1A受體多克隆抗體購自Sigma；鼠抗PSD-95多克隆抗體購自Abcam；FITC標記的羊抗兔熒光II抗、Cy3標記的羊抗鼠熒光II抗、Triton X-100、 BSA等均購于碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器 Morris水迷宮(北京醫(yī)學科學院藥物研究所研制)；熒光顯微鏡和冰凍切片機(OLYMPUS)；大鼠腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)；BL-420S生物信號分析系統(tǒng)、微量注射泵(成都泰盟科技有限公司);高速冷凍離心機(Beckman)。

2 方法

2.1 實驗動物分組 實驗動物隨機分為正常對照組和模型組，每組18只。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠6只，采用國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，供應充足水分。

2.2 PTSD動物模型的制備 按照文獻[6]的方法，模型組大鼠連續(xù)進行以下步驟處理：禁錮2 h，強迫性游泳20 min(水深40 cm，水溫25 ℃)；休息15 min后乙醚麻醉至意識喪失。各組動物無干擾飼養(yǎng)，常規(guī)攝食飲水，飼養(yǎng)溫度為(22±1)℃。

2.3 行為學測試 造模之后24 h，2組大鼠行Morris水迷宮實驗。訓練期間迷宮外參照物保持不變，訓練共進行4 d，每天2次，每次訓練時間間隔15 min。

2.4 動物手術 Morris水迷宮實驗結束之后24 h，2組各取1/3大鼠(6只)經10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立體定位儀上，切開頭部皮膚，暴露硬腦膜。定位海馬CA1(前囟向后7.5 mm、左旁4.2 mm、顱骨表面向下3.0 mm)植入刺激電極，于同側海馬齒狀回(前囟向前3.8 mm、左旁2.5 mm、顱骨表面向下3.5 mm)植入記錄電極E1，兩者都以E2(前囟向前2.0 mm、左旁2.0 mm、顱骨表面向下3.0 mm)為參考，所有操作均在無菌條件下進行，術后肌注慶大霉素抗感染。

2.5 電生理實驗 各組1/3大鼠(6只)行為學實驗完畢之后進行電生理實驗。

2.5.1 誘發(fā)電位的記錄 測試刺激由電子刺激器產生(頻率為10 Hz、波寬為0.1 ms的方波)，誘發(fā)的動作電位經生物放大器在記憶示波器上顯示，記錄最大群峰電位(population spike，PS)幅值作為海馬細胞群興奮性的指標。調整刺激強度，采用引起最大PS幅值所需刺激強度的1/2作為測試刺激的強度，整個實驗過程中測試刺激強度參數(shù)恒定不變。

2.5.2 高頻刺激(high-frequency stimulation，HFS)誘導長時程增強(long-term potentiation，LTP) HFS電流強度同測試刺激，刺激串間隔為100 ms，刺激頻率為200 Hz的10串刺激，每串刺激由5個波寬0.1 ms的方波組成，高頻刺激的頻率為200 Hz，連續(xù)給予2次。以給藥前30 min記錄的6個時點的PS幅值的平均值作為自身基礎幅值，每個時點的突觸傳遞水平以與基礎突觸傳遞水平比較得出的相對值表示，相對值(%)=(實測值-相對值)/相對值×100%。

2.6 Western blot實驗 各組另1/3大鼠(6只)行為學實驗完畢之后進行Western blot實驗。 大鼠在腹腔麻醉后快速取出全腦，冰浴分離出海馬，RIPA充分裂解提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(Novagen)測定蛋白濃度。調節(jié)各組蛋白濃度統(tǒng)一為0.5 g/L，加2×SDS上樣緩沖液，99 ℃變性10 min。每孔中加10 μL樣品，Tris-SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳電轉印到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗5-HT1A受體和PSD-95抗體，4 ℃過夜，傾去I 抗，TBST洗膜3次，每次15 min。分別加入1∶2 000羊抗兔、羊抗鼠甘油 II 抗，置于搖床上搖動，室溫下1 h；棄去 II 抗，TBST洗膜 15 min×3次；凝膠成像分析系統(tǒng)成像，檢測蛋白質印跡條帶，ImageJ軟件分析求得平均吸光度值。

2.7 免疫熒光實驗 各組最后1/3大鼠進行免疫熒光實驗。將各組大鼠灌注后取腦，置于4% 多聚甲醛溶液中過夜，經30%蔗糖溶液脫水后，用恒溫(-20 ℃)冰凍切片機作冠狀切片，厚度30 μm，隔 4片取 1片腦片，切片經0.3% Triton X-100通透2 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，10% BSA封閉1 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。滴加5-HT1A受體和PSD-95 I 抗， 4 ℃ 條件下孵育過夜；復溫后0.01 mol/L PBS漂洗5 min、3 次。暗室加入FITC標記的羊抗兔II抗和Cy3標記的羊抗鼠II抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，DAPI染核，防淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍片，每張切片檢測海馬CA1區(qū)平均陽性細胞數(shù)和積分吸光度值(用IPP 6.0軟件分析)。

3 統(tǒng)計學處理

經SPSS 16.0處理，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)分析前經正態(tài)分布和方差齊性檢驗，兩組間資料的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Morris水迷宮實驗，不同組別大鼠逃避水下平臺潛伏期的比較

在水迷宮實驗中，從實驗第2天開始，與對照組比較，模型組大鼠逃避水下平臺時間明顯延長(P<0.05)，見圖1。

Time (d)

Figure 1.Comparison of the latency between 2 groups of the rats escaping the platform on different experimental days. Mean±SD.n=18.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 2組大鼠不同實驗日逃避水下平臺潛伏期的比較

2 電生理實驗 HFS對大鼠海馬神經元電活動的影響

兩組大鼠HFS均能誘導海馬神經元突觸傳遞明顯增強，呈現(xiàn)LTP樣電位變化。對LTP幅值增加的相對值進行比較，與對照組比較，模型組明顯下降(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The PS amplitudes of the rats before and after HFS in control group and model group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖2 2組大鼠在強直性高頻刺激后PS幅值增加相對值的比較

3 Western blot實驗檢測不同組別大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A受體和PSD-95的表達

與對照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A受體的表達明顯增加(P<0.01)，但PSD-95的表達明顯減少(P<0.01)，見圖3。

4 免疫熒光實驗檢測不同組別大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A受體和PSD-95的表達

熒光顯微鏡下，海馬CA1區(qū)5-HT1A受體及DAPI染色結果顯示，與對照組比較，模型組海馬神經元胞體增大，胞核增大、胞核染色較淡,海馬CA1區(qū)神經元胞漿內可見FITC標記的綠色熒光免疫反應陽性產物為5-HT1A受體蛋白，對照組大鼠5-HT1A受體陽性細胞熒光染色淺，而模型組大鼠5-HT1A受體陽性細胞熒光染色強(圖4)。

Figure 3.Western blot analysis of 5-HT1Areceptor and PSD-95 expression in the CA1 region of hippocampus in the 2 groups of the rats. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖3 Western blot實驗檢測2組大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A和PSD-95的表達

Figure 4.Immunofluorescence observation of 5-HT1Areceptor expression in CA1 region of hippocampus in the 2 group of the rats. The scale bar=20 μm.

圖4 免疫熒光實驗檢測2組大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A受體的表達

海馬CA1區(qū)PSD-95蛋白及DAPI染色結果顯示，與對照組比較，模型組海馬細胞排列稀疏，胞核數(shù)量減少；海馬CA1區(qū)神經元胞漿內可見Cy3標記的紅色熒光免疫反應陽性產物為PSD-95蛋白，對照組大鼠PSD-95陽性細胞熒光染色深，而模型組大鼠PSD-95陽性細胞熒光染色淺(圖5)。

陽性細胞計數(shù)顯示，與對照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A受體陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.05)，而PSD-95陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，見圖6。

平均積分吸光度的比較結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A受體積分吸光度明顯增強(P<0.05)，而PSD-95蛋白積分吸光度明顯減弱(P<0.05)，見圖7。

討 論

PTSD是一種典型的應激障礙性疾病，應激適應能力可能與腦內5-HT遞質系統(tǒng)密切相關，5-HT功能失調可能是PTSD的重要病因學基礎[7-8]。其中5-HT1A受體與焦慮、抑郁等精神疾病關系尤為密切[9-10]。5-HT1A受體分為突觸前膜和突觸后膜受體，突觸前膜5-HT1A受體屬自身受體，主要位于中縫核5-HT能神經元胞體和樹突處，對5-HT系統(tǒng)起負反饋調節(jié)作用，其激活后能抑制5-HT神經元電活動，減少突觸前膜5-HT的釋放。突觸后膜5-HT1A受體則主要位于海馬CA1區(qū)和其他邊緣葉區(qū)的錐體細胞,其轉導機制主要是通過G蛋白偶聯(lián)抑制cAMP酶活性，使得第二信使cAMP合成減少, 使突觸后膜發(fā)生超極化，使突觸后神經元抑制。

Figure 5.Immunofluorescence observation of PSD-95 expression in the CA1 region of hippocampus in the 2 groups of the rats. The scale bar=20 μm.

圖5 免疫熒光實驗檢測2組大鼠海馬CA1區(qū)PSD-95的表達

Figure 6.Comparison of 5-HT1Areceptor and PSD-95 positive cells in the CA1 region of hippocampus in the 2 groups of the rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖6 大鼠海馬CAI區(qū)5-HT1A和PSD-95免疫反應陽性細胞計數(shù)的比較

Figure 7.Comparison of the meanIAof 5-HT1Areceptor and PSD-95 in the CA1 region of hippocampus in the 2 groups of the rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖7 大鼠海馬CAI區(qū)5-HT1A受體和PSD-95平均積分吸光度的比較

在本實驗中，利用SPS構建PTSD大鼠模型， Morris水迷宮實驗結果表明，模型大鼠逃避水下平臺的潛伏期較對照組明顯延長，目標象限的停留時間較對照組明顯縮短，說明了模型組大鼠的空間記憶能力明顯減退，這些都符合PTSD 的臨床特征，說明PTSD模型復制成功。

LTP和長時程壓抑(long-term depression，LTD)是突觸可塑性的重要表現(xiàn)形式[11]。LTP是學習記憶的神經基礎，也是研究學習與記憶機制的理想模型，而海馬是學習記憶活動的關鍵腦區(qū)，在空間記憶的形成中起著關鍵作用[12]。在電生理實驗中，強直性高頻刺激均可在2組大鼠海馬誘導出穩(wěn)定的LTP，但是在幅值上，模型組顯著低于對照組，說明了創(chuàng)傷后應激障礙大鼠神經元可塑性功能減退。

在Western blot實驗和免疫熒光實驗中，5-HT1A受體蛋白的表達，與對照組比較，模型組明顯增多。這與Liu等[3]研究創(chuàng)傷后應激對大鼠前額葉和海馬5-HT1A受體蛋白的影響是一致的。徐愛軍等[13]研究創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬5-HT1A受體的表達較對照組顯著性減少，本實驗結果與之存在一定差異，分析其原因，可能與組織取材的時點不同有關，在該實驗中，對5-HT1A受體的檢測是在PTSD造模完成之后立即進行，而本實驗研究中，對5-HT1A受體的檢測是在水迷宮實驗結束之后進行的，所以導致了實驗結果的差異。

突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)是位于突觸活性區(qū)突觸后膜下方與胞漿相連的一層致密物質，其中PSD-95又稱突觸相關蛋白90(synapse-associated protein 90, SAP-90)，是新近在谷氨酸能突觸中發(fā)現(xiàn)的一種特殊蛋白質。研究表明，PSD-95能夠介導逆行性信號傳遞，促進突觸前膜突觸素的表達增加，增強大鼠的空間記憶能力[14]。王雪銀等[15]的研究表明，PSD-95和GluR1的表達增加，能夠增強阿爾茨海默病大鼠的空間學習記憶能力。Western blot實驗和免疫熒光實驗均表明PTSD模型大鼠海馬PSD-95的表達較對照組明顯減少，學習記憶相關蛋白的表達減少，導致模型大鼠的空間記憶能力減退。在本實驗中，PTSD模型組大鼠海馬神經元DAPI染色結果圖片也顯示其細胞核數(shù)量較對照組明顯減少，分析其原因，可能是連續(xù)性單刺激導致大鼠創(chuàng)傷后應激障礙，進而引起海馬神經元的損傷，甚至是神經元的壞死所致。這與梁冬施等[16]研究慢性缺氧性應激能導致大鼠海馬神經元出現(xiàn)損傷、凋亡等病理變化是一致的。

本實驗從行為學、在體電生理、Western blot、免疫熒光等多種方法證實PTSD模型大鼠空間記憶能力減退，突觸可塑性功能減退，可能與創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1A受體表達增加和PSD-95蛋白表達減少有關。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of 5-HT1Areceptor in hippocampal CA1 region on spatial memory of PTSD rats

LIN Ling, LIU Guo-liang, SUN Man-li

(LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China.E-mail:linlingshengli@126.com)

AIM: To investigate the change of long-term potentiation (LTP), and the expression of 5-hydroxytryptamine 1A receptor (5-HT1Areceptor) and postsynaptic density protein 95 (PSD-95) in the hippocampus of the rats with posttraumatic stress disorder (PTSD), and to explore the mechanism of 5-HT1Areceptor in the regulation of spatial memory in the PTSD rats.METHODS: Healthy adult SD rats (n=36) were randomly divided into control group and model group, with 18 rats in each group. The rats in model group were treated with single prolonged stress to construct the model of PTSD. Morris water maze (MWM) was used to test the learning and memory ability. The LTP induced by high-frequency stimulation (HFS) was detected by electrophysiological method. The protein expression of 5-HT1Areceptor and PSD-95 in the hippocampus was determined by Western blot and immunofluorescence. RESULTS: The MWM analysis showed that the latency of the rats searching for the underwater platform in model group was significantly longer than that in control group (P<0.01). The results of electrophysiological analysis showed that the amplitude of the evoked potential in both groups were significantly increased after HFS in the hippocampus, but that in model group was significantly lower than that in control group (P<0.01). The results of Western blot and immunofluorescence analysis showed that compared with control group, the protein expression of 5-HT1Areceptor was obviously increased (P<0.05), while the expression of PSD-95 was obviously decreased in model group (P<0.05).CONCLUSION: The spatial memory impairment in the PTSD rats may be associated with the increase in the expression of 5-HT1Areceptor and the decrease in the expression of PSD-95 in the CA1 region of hippocampus.

Posttraumatic stress disorder; Hippocampus; 5-HT1Areceptor; Postsynaptic density protein 95; Learning and memory

1000- 4718(2017)01- 0098- 06

2016- 07- 25

2016- 10- 19

河南省科技廳自然科學資助項目(No. 142300410431)；河南省教育廳高等學校重點科研資助項目(No.15B180010)；漯河市青年拔尖人才資助項目; 漯河醫(yī)學高等?？茖W?？蒲许椖?2015-S-LMC06)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.016

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