余瀟苓， 趙燕娜， 鄭智茵， 高瑞蘭， 尹利明

(浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江 杭州 310006)

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地西他濱抑制K562白血病細胞增殖和誘導分化的作用*

余瀟苓， 趙燕娜， 鄭智茵， 高瑞蘭， 尹利明△

(浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江 杭州 310006)

目的： 觀察地西他濱(DAC)抑制白血病K562細胞生長和誘導分化的作用。方法: 不同濃度的DAC處理K562細胞。MTT法和半固體集落生成實驗檢測K562細胞增殖能力；瑞氏染色觀察細胞形態(tài)；流式細胞術檢測分化相關抗原CD11b和CD42b陽性表達率；Western blot 檢測細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細胞周期蛋白E1(cyclin E1)、細胞周期負調控因子P27、紅系分化核轉錄因子GATA-1及粒系分化核轉錄因子PU.1蛋白的表達水平。結果: DAC能夠減少K562 細胞集落形成的數(shù)量，降低細胞活力，減少核質比，抑制K562細胞進入S期，并阻滯在G2/M期，提高分化相關抗原CD11b和CD42b陽性表達率，上調P27、GATA-1 和PU.1蛋白表達，同時下調CDK2和cyclin E1蛋白表達。結論: DAC可能通過調控細胞周期抑制K562細胞增殖，同時誘導多向分化。

地西他濱； 白血??； 細胞增殖； 分化； 細胞周期

白血病是嚴重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在兒童和青年的惡性腫瘤中位居首位，其生物學特征是造血細胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡過程發(fā)生障礙，以致異常分化的細胞大量增殖。近年研究發(fā)現(xiàn)白血病細胞抑癌基因啟動子CpG島高度甲基化，導致抑癌基因沉默，可能是白血病細胞增殖失控和分化阻滯的原因之一[1]。DNA甲基化轉移酶抑制劑能夠誘導甲基化沉默基因表達，而表達的抑癌基因能夠調控細胞增殖。地西他濱(decitabine; 商品名Dacogen，DAC)是一種DNA甲基化轉移酶抑制劑，低劑量能夠誘導DNA去甲基化和造血干細胞分化[2]，而高劑量則有細胞毒作用。目前，治療骨髓增生異常綜合征的療效確切[3]，而用于白血病的治療正在探索中[4-6]。本研究觀察DAC 抑制K562白血病細胞增殖和誘導分化的作用，并初步探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

K562細胞由浙江省中醫(yī)院血液病研究所保存；DAC 購自Sigma；注射用水和細胞培養(yǎng)液稀釋為20 mmol/L，4 ℃保存?zhèn)溆?；IMDM培養(yǎng)基購自 Gibco；小牛血清購自杭州四季青公司；PE標記的小鼠抗人CD11b和CD42b抗體購自BD；抗細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)、細胞周期蛋白E1(cyclin E1)、P27、GATA-1和PU.1抗體購自Cell Signaling Technology；抗β-actin抗體購自聯(lián)科生物技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將K562細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的IMDM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

2.2 MTT實驗檢測細胞活力 取對數(shù)生長K562細胞，調整細胞濃度至1×108/L，分別加入不同濃度DAC和陽性對照藥物佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)，分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔2×104細胞(200 μL)，復種6孔。DAC 終濃度分別為0、0.1、0.2和0.4 μmol/L，TPA終濃度為0.1 μmol/L。上述培養(yǎng)體系置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入5 g/L MTT 20 μL，在相同條件下繼續(xù)孵育4 h。離心棄上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，微量振蕩器振蕩5 min，使結晶完全溶解，酶標儀檢測490 nm波長的吸光度，計算各實驗組細胞生長的抑制率。該實驗重復3次。細胞抑制率(%)=(對照組吸光度-實驗組吸光度)/對照組吸光度×100%。

2.3 K562細胞半固體集落形成實驗 計數(shù)并調整細胞濃度為5×106/L，進行K562白血病細胞集落培養(yǎng)，分別加入不同濃度的DAC和TPA。DAC終濃度為0、0.1、0.2和0.4 μmol/L，TPA終濃度為0.1 μmol/L。培養(yǎng)體系為IMDM培養(yǎng)液、30%小牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U青/鏈霉素和0.3%瓊脂，接種于24孔板， 每孔2.5×102個細胞(0.5 mL)，重復3孔。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。以大于40個細胞的聚合為一個K562白血病細胞集落，記錄K562白血病細胞集落數(shù)，并計算抑制率(%)=(對照組集落數(shù)-實驗組集落數(shù))/對照組集落數(shù)×100%。該實驗重復3次。

2.4 瑞氏染色(Wright’s staining)觀察細胞形態(tài)的改變 取對數(shù)生長K562細胞，調整細胞濃度至1×108/L，分別加入不同濃度DAC 和TPA，分別接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105細胞(3 mL)。DAC 終濃度分別為0、0.1、0.2和0.4 μmol/L，TPA終濃度為0.1 μmol/L。上述培養(yǎng)體系置37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液，培養(yǎng)7 d后收集細胞，細胞離心涂片機制作細胞涂片。瑞氏染色，油鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

2.5 流式細胞術檢測分化相關抗原陽性表達率 收集各組細胞，PBS洗滌并調整細胞濃度為1×109/L，取100 μL細胞懸液分別加入抗分化相關抗原CD11b和CD42b的單克隆抗體，4 ℃孵育30 min，PBS洗去未結合的抗體，流式細胞術檢測細胞陽性表達率，每一個檢測標本記錄10 000個細胞。DIVA軟件進行陽性率的分析。同樣的實驗重復3次。

2.6 Western blot 法檢測K562細胞CDK2、cyclin E1、P27、GATA-1和PU.1的蛋白表達 按照本研究所已報道的方法[7]，采用細胞裂解液(含50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。將40 μg蛋白加入SDS凝膠加樣緩沖液20 μL中煮沸后，經SDS-PAGE分離后，將蛋白條帶用電轉移到NC膜上，分別加特異性的抗CDK2、cyclin E1、P27、GATA-1和PU.1抗體，4 ℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，經充分洗滌后用ECL發(fā)光劑。采用灰度掃描系統(tǒng)測定并分析目的蛋白條帶。同樣的實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，藥物實驗組與對照組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 地西他濱抑制K562細胞增殖

DAC處理K562細胞3 d，0.1～0.4 μmol/L組的A值分別為0.61±0.04、0.54±0.03和0.50±0.03，其中0.2和0.4 μmol/L DAC組的A值明顯低于對照組(P<0.05)。DAC處理K562細胞7 d，0.1～0.4 μmol/L組的K562細胞集落數(shù)分別為109.3±8.1、72.3±7.9和48.0±8.4(每103個K562細胞)，顯著低于對照組(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The proliferation of K562 cells detected by MTT assay (A) and colony formation assay (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 MTT實驗和集落形成實驗證實DAC抑制K562細胞增殖

2 DAC 誘導K562細胞形態(tài)學改變

DAC 處理K562細胞7 d，瑞氏染色顯示隨著藥物濃度增大，K562細胞體積增大，胞漿豐富，核漿比減少，胞漿內可見空泡等細胞形態(tài)學改變，見圖2。

3 地西他濱提高K562細胞分化相關抗原陽性表達率

地西他濱處理K562細胞7 d，流式細胞術檢測K562細胞分化程度，結果顯示K562細胞分化相關抗原CD11b和CD42b陽性表達率均明顯高于對照組，且呈一定的劑量依賴關系，見圖3、表1。

4 DAC 對K562細胞周期的影響

不同濃度DAC處理K562細胞72 h，流式細胞術分析細胞周期分布情況。結果顯示隨著藥物濃度的增加，S期細胞的比例逐漸減少，G2/M期的細胞比例逐漸增加，見圖4、表1。

5 DAC 對K562細胞周期和分化相關蛋白表達水平的影響

Western blot實驗結果顯示，隨著藥物濃度增加，CDK2和cyclin E1的蛋白表達水平逐漸降低，而P27、GATA-1和PU.1的蛋白表達水平逐漸增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 2.The morphologial changes of K562 cells induced by DAC (×400). A: control; B: 0.1 μmol/L DAC; C: 0.2 μmol/L DAC; D: 0.4 μmol/L DAC; E: TPA.

圖2 DAC對K562細胞形態(tài)的影響

Figure 3. DAC increased the CD11b and CD42b positive rate in K562 cells.

圖3 DAC提高K562細胞CD11b和CD42b陽性表達率

Figure 4. DAC changed the cell cycle distribution of the K562 cells.

圖4 DAC對K562細胞細胞周期分布的影響

表1 DAC對細胞CD11b和CD42b陽性率和細胞周期分布的影響

Table 1.The effects of DAC on the CD11b and CD42b positive rates and the cell cycle distribution of the K562 cells (%. Mean±SD.n=3)

TreatmentCD11bCD42bG0/G1SG2/MControl3．51±0．327．92±0．5744．91±4．2147．14±3．857．96±1．200．1μmol/LDAC4．20±0．33?16．10±1．04??35．06±3．14?33．66±2．98?27．49±2．13??0．2μmol/LDAC8．10±0．73??30．21±3．68??36．66±3．11?28．14±2．01??36．20±2．87??0．4μmol/LDAC5．38±0．47?13．80±0．89??35．40±3．24?25．52±2．57??39．09±3．47??TPA12．21±0．44??14．80±0．43??53．84±4．16??37．75±3．11??8．04±0．68

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

討 論

DAC是一種DNA甲基化轉移酶抑制劑，具有去甲基化的作用。該藥在血液系統(tǒng)疾病如骨髓增生異常綜合征的實驗研究和臨床應用方面已取得令人滿意的療效，并且在治療髓系白血病方面也有較好的療效，但是機制尚不明確。

在一定誘導因素作用下，白血病K562細胞株可向紅系、粒-單系和巨核系細胞分化，是研究白血病細胞增殖與分化的理想細胞模型。我們觀察到每103個K562細胞能夠形成264.7±19.1個集落，也就是這些集落來自于264.7±19.1個原始細胞，表明每個K562細胞的增殖能力不同，具有異質性的特點，提示能夠形成集落的K562細胞更原始。同時，我們發(fā)現(xiàn)濃度為0.1～0.4 μmol/L的DAC能夠顯著減少K562細胞形成集落的數(shù)量，抑制K562細胞原始細胞的增殖，抑制率達到58.7%～81.9%。MTT實驗的結果顯示，濃度為0.1～0.4 μmol/L的DAC抑制K562細胞增殖，抑制率達到10.3%～25.6%。MTT實驗是以K562細胞群作為觀察對象，白血病細胞集落形成實驗以K562細胞群中原始細胞作為觀察對象。因此，2種實驗相結合能夠更全面地觀察和分析DAC抑制K562細胞增殖的作用。

阻止白血病細胞進入細胞周期，抑制惡性增殖是抗白血病常用手段和療法[8-9]。研究表明，DAC對細胞周期分布的影響具有時效性和空間性。熊鳴等[10]報道DAC處理K562耐藥細胞24 h，發(fā)現(xiàn)S期細胞比例減少，G2/M期細胞無變化；而處理48 h， G2/M期細胞比例增加。韓新愛等[11]報道，DAC處理K562細胞72 h后，G0/G1期細胞比例顯著增高，S期細胞比例降低， G2/M期細胞比例無變化。國外文獻報道DAC抑制腫瘤細胞進入細胞周期，并阻滯在G2/M期[12-13]。我們的實驗結果顯示DAC處理K562細胞72 h，上調細胞周期負調控因子P27蛋白表達，下調細胞周期 CDK2和cyclin E1蛋白的表達，抑制細胞進入S期，同時細胞阻滯在G2/M期，與已報道的結果基本一致，但略有不同，可能是藥物濃度不同所致。此外，陽性對照藥物TPA增加G0/G1期K562細胞比例，降低S期細胞比例，而G2/M期細胞比例無變化，其對細胞周期的作用與DAC不同。

目前，針對白血病分化阻滯的發(fā)病機制，誘導白血病細胞分化以治療髓系白血病的方法受到關注，但是臨床上常用的細胞分化誘導劑應用范圍局限，如砷劑和維甲酸僅限于治療M3早幼粒白血病患者，難于滿足臨床需要。研究發(fā)現(xiàn)，基因組甲基化程度的高低水平調控細胞分化能力[14-15]，進一步發(fā)現(xiàn)甲基化水平與分化程度呈正相關。我們觀察了DAC誘導K562細胞分化的作用，在0.1～0.4 μmol/L的濃度范圍內，DAC能夠誘導K562細胞分化，不僅有細胞形態(tài)學的改變，而且細胞分化抗原和分化相關蛋白的表達水平均也有不同程度的提高，提示DAC非特異性誘導K562細胞向多系分化。然而，陽性對照藥TPA誘導K562細胞分化的作用不同于DAC；TPA增加粒系分化抗原CD11b陽性表達的細胞比例較多，而巨核系分化抗原CD42b表達陽性的細胞比例較少，提示TPA誘導K562細胞趨于分化為粒系。

Figure 5.DAC regulated the protein expression of CDK2, cyclinE1, P27, GATA-1 and PU.1 in the K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 DAC對K562細胞CDK2、cyclinE1、P27、GATA-1和PU.1蛋白表達水平的調節(jié)作用

綜上所述，本研究初步探討了DAC誘導髓系白血病分化的作用。但仍有許多問題有待進一步解決，譬如DAC臨床應用的誘導分化劑量、誘導K562細胞分化的去甲基化機制、誘導K562細胞分化的細胞周期分布等。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of decitabine on proliferation and differentiation of K562 cells

YU Xiao-ling, ZHAO Yan-na, ZHENG Zhi-yin, GAO Rui-lan, YIN Li-ming

(InstituteofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China.E-mail:yinlm_hz@163.com)

AIM: To investigate the effect of decitabine (Dacogen, DAC) on the proliferation and differentiation of K562 cells. METHODS: The K562 cells were treated with different concentrations of DAC. The colony formation ability of the cells was detected by the colony formation assay with semi-solid culture. The cell viability was detected with MTT assay. The morphologic features were observed under inverted microscope with Wright’s staining. The changes of the cell cycle distribution and the expression of CD11b and CD42b were analyzed with flow cytometry. The protein expression of CDK2, cyclin E1, P27, GATA-1 and PU.1 in the K562 cells was determined by Western blot. RESULTS: DAC significantly decreased the colony number of the cells and cell viability in a dose-dependent manner. The morphological changes of the cells displayed partial differentiation. After treated the K562 cells with DAC for 72 h, the cell proportion in S phase was obviously decreased, while the cell proportion in G2/M phase was obviously increased in a dose-dependent manner. After treated the K562 cells with DAC for 7 d, the percentage of CD11b and CD14 positive cells was further elevated, and the protein expression of P27, GATA-1 and PU.1 was increased. However, the protein expression of CDK2 and cyclin E1 was decreased. CONCLUSION: DAC inhibits the proliferation and induces differentiation of the K562 cells via regulation of cell cycle.

Decitabine; Leukemia; Cell proliferation; Differentiation; Cell cycle

1000- 4718(2017)01- 0013- 05

2016- 07- 22

2016- 11- 14

國家自然科學基金資助項目(No. 81373876)；浙江省自然科學基金資助項目(No. Y14H290004)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.003

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△通訊作者 Tel: 0571-87071625； E-mail： yinlm_hz@163.com