薛麗霞

天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300193)

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·實驗研究·

復(fù)方莪術(shù)散對子宮內(nèi)膜異位癥黏附因子表達的影響

薛麗霞

天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300193)

目的:觀察子宮內(nèi)膜異位癥ICAM-1的表達情況，并探討復(fù)方莪術(shù)散對其表達的影響。方法 :建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，WB檢測不同子宮內(nèi)膜組織ICAM-1的表達；并取異位細胞進行原代細胞培養(yǎng)，同時用高中低劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)子宮內(nèi)膜異位癥異位原代培養(yǎng)細胞，分別在24 h、48h和72 h利用WB檢測ICAM-1的表達情況。結(jié)果: WB結(jié)果顯示，與非內(nèi)異癥大鼠正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠在位組織和異位組織ICAM-1相對表達量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中異位組織較在為組織ICAM-1升高更為明顯(P<0.05和<0.01)。獨立樣本t檢驗顯示，高中低劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)組表達明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)論: ICAM-1蛋白子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜組織呈現(xiàn)高表達，而復(fù)方莪術(shù)散能夠有效抑制子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜細胞ICAM-1蛋白的表達，為治療子宮內(nèi)膜異位提供了良好的方法。

子宮內(nèi)膜異位癥簡稱內(nèi)異癥，其典型病理特征是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜以外的部位，且生長、浸潤、反復(fù)出血，可形成結(jié)節(jié)及包塊，是引起疼痛和不育的主要原因[1]。據(jù)估計育齡婦女中內(nèi)異癥的流行率約為10%～15%，而50～60%各種形式盆腔痛的育齡女性和青春期女性和50%的不育女性均合并內(nèi)異癥[2]。內(nèi)異癥雖然為良性病變，卻具有惡性行為，復(fù)發(fā)率高，嚴重影響女性的身心健康[3]。目前，其病因和致病機制復(fù)雜，有子宮內(nèi)膜種植學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、淋巴和靜脈播散學(xué)說等[4]。其中，“經(jīng)血逆流種植”學(xué)說最為經(jīng)典。異位的子宮內(nèi)膜通過“黏附-侵襲-血管生成”侵襲其他部位[5]，其間涉及眾多粘附因子包括細胞間黏附因子-1(ICAM-1)、CD44、CA125、CA199等。研究顯示，異位內(nèi)膜ICAM-1和CD44表達增高[6]。中醫(yī)認為血瘀是該病致病的關(guān)鍵。中藥方劑復(fù)方莪術(shù)散具有補腎活血、軟堅散結(jié)等功效，治療內(nèi)異癥具有良好效果[7]。本研究通過建立子宮內(nèi)膜異位大鼠模型觀察病變組織ICAM-1表達的變化，然后利用不同劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)子宮內(nèi)膜異位癥異位細胞并其對ICAM-1表達的影響，以確證其對黏附作用的影響。

材料和方法

1 實驗材料 清潔級雌性SD大鼠(由上海生命科學(xué)院實驗動物中心提供，合格證：SYXK滬2004-0012)、苯甲酸雌二醇、異戊巴比妥那、大鼠飼料(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)、復(fù)方莪術(shù)散(方藥組成：三棱、莪術(shù)、淫羊藿、延胡索、黃芪，組方中個單藥劑量由江陰天江藥業(yè)有限公司制成顆粒劑型，其中低劑量各單藥5 g， 中劑量10 g,高劑量20 g)、DMEM培養(yǎng)基、組織勻漿器、RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)、RIPA蛋白裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)、β-actin抗體(碧云天生物技術(shù)公司)、抗ICAM-1抗體(Sigma公司)、HRP-山羊抗小鼠二抗(碧云天生物技術(shù)公司)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)、

2 子宮內(nèi)膜異位大鼠模型建立 實驗動物為6～8周齡，健康成熟未交配的清潔級雌性SD大鼠，平均體重165～182 g，按照清潔級動物要求進行飼養(yǎng)，自由取水，室溫24℃，相對濕度50±10%，明暗照明各12 h，實驗前適應(yīng)性飲食2周。動物模型建立參照文獻[8]，簡要步驟如下：按照30 μg/kg劑量連續(xù)皮下注射苯甲酸雌二醇3D，陰道涂片觀察以確定大鼠動情期，在動情期進行手術(shù)造模。按60 mg/kg劑量腹腔注射異戊巴比妥那進行麻醉，無菌條件下剖腹，結(jié)扎子宮系膜血管，左側(cè)子宮縱向切開，分離出子宮內(nèi)膜0.5 cm× 0.5cm并縫合于右側(cè)腹腔內(nèi)壁血管豐富處。術(shù)后三周剖腹，測量異位內(nèi)膜體積，以體積≥20 mm3、內(nèi)膜囊泡見透明積液為造模成功。

3 細胞培養(yǎng)及低、中、高劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)處理 選取建模成功大鼠異位子宮內(nèi)膜組織保存在DMEM培養(yǎng)液中，2h內(nèi)進行細胞培養(yǎng)處理。細胞原代培養(yǎng)方法參照Ryan[9]等的方法，簡要步驟如下：PBS將內(nèi)膜組織洗滌3次；用眼科剪將其剪成碎塊，加入2～5倍體積的消化液(含1%膠原酶和0.25%胰蛋白酶)，于細胞培養(yǎng)箱中消化90 min，至可見葡萄串狀上皮細胞及單個間質(zhì)細胞。將消化好的細胞懸液離心去上清，加入DMEM漂洗沉淀2次后，加入DMEM完全培養(yǎng)基，吹打混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。應(yīng)用免疫組化染色法鑒定上皮細胞(角質(zhì)蛋白染色)和間質(zhì)細胞(波形蛋白染色)。將對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞分別應(yīng)用含低、中、高濃度的復(fù)方莪術(shù)散DMEM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h，48 h及72 h后，收集細胞。

4 WB檢測ICAM-1表達

4.1 細胞和組織蛋白的提取組織蛋白提?。悍謩e取適量非內(nèi)異癥大鼠正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜異位癥在位組織和異位組織至勻漿器球狀部位，用干凈組織剪將其剪碎；加入400μl RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司)于勻漿器中，冰上勻漿；冰上裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，超聲10～15 s后，4℃，12,000rpm 離心5 min，收集上清于離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩＜毎鞍滋崛。簩⑾鄳?yīng)處理時期的細胞，棄培養(yǎng)基，加預(yù)冷PBS洗2次，將PBS棄凈后置于冰上，加RIPA裂解液200μl冰上裂解30 min。刮取細胞并將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，超聲10～15 s后，4℃，12,000rpm 離心5 min，收集上清于離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2 WB檢測:應(yīng)用WB檢測組織和細胞ICAM-1的表達情況，簡要步驟如下：利用將10%的蛋白電泳分離膠和4%的蛋白電泳濃縮膠進行蛋白電泳；用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜； 用8%脫脂混勻牛奶封閉2 h；按1∶1 000稀釋β-actin抗體和抗ICAM-1抗體，4℃孵育過夜；洗滌過后1∶10 000比例用TBST稀釋結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h；洗滌后曝光顯影。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶，并用ImageJ圖像采集分析系統(tǒng)計算WB灰度值，以樣品條帶/β-actin相對含量為蛋白含量的表達。

5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細胞形態(tài)觀察 細胞體外培養(yǎng)24 h后，大部分上皮細胞已貼壁呈團狀生長排列，腺細胞呈多角形或蝌蚪形，為致密的細胞集落，邊界清楚。間質(zhì)細胞為多角形或梭形。

2 子宮內(nèi)膜異位大鼠不同子宮內(nèi)膜組織ICAM-1表達 WB結(jié)果顯示，與非內(nèi)異癥大鼠正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠在位組織和異位組織ICAM-1相對表達量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中異位組織較在為組織ICAM-1升高更為明顯(p<0.05和<0.01)，見圖1。

圖1 不同子宮內(nèi)膜組織ICAM-1表達

2 復(fù)方莪術(shù)散對子宮內(nèi)膜異位原代細胞ICAM-1表達的影響 WB結(jié)果顯示，空白對照組ICAM-1蛋白高表達；復(fù)方莪術(shù)散高劑量干預(yù)組與空白對照比較，復(fù)方莪術(shù)散高、中、低劑量干預(yù)組ICAM-1蛋白表達量明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(見表1)。

表1 不同劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)后細胞ICAM-1表達變化

注：與空白組比較，*P<0.05

討 論

復(fù)方莪術(shù)散包括莪術(shù)、三棱、淫羊藿、延胡索和黃芪5味中藥，活血化瘀、行氣止痛、益腎扶正[10]。動物實驗表明，該藥可降低異位內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，抑制新生血管形成及病灶侵襲[11]。ICAM-1是一種淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1的配體，含有505個氨基酸，屬于細胞粘附分子中的免疫球蛋白超級家族一員，廣泛存在于細胞表面和細胞外基質(zhì)包括子宮內(nèi)膜上皮細胞和細胞間質(zhì)。其不僅可以介導(dǎo)細胞-細胞間黏附作用，也參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生長、炎癥反應(yīng)等生理和病例過程[12]。子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞有較多的ICAM-1表達。多種研究證實，該蛋白在內(nèi)異癥患者血清中明顯升高[13]；在異位病灶中高表達[5, 14]。該蛋白可能在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

本研究成功建立了子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，并觀察了ICAM-1在非內(nèi)異癥大鼠正常子宮內(nèi)膜組織、在位組織(P<0.05)和異位組織的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥在位組織和異位組織ICAM-1的表達均增高，其中異位組織ICAM-1增高最多，提示ICAM-1可能在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展中起著在重要作用。同時，本研究利用不同劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜細胞，并觀察了其對ICAM-1蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方莪術(shù)散能有效抑制該蛋白在子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜細胞的表達，提示復(fù)方莪術(shù)散治療子宮內(nèi)膜異位癥有重要作用。其可能通過抑制ICAM-1蛋白表達，影響異位子宮內(nèi)膜的黏附從而達到治療的效果。

綜上所述，ICAM-1在子宮內(nèi)膜異位癥在位組織和異位組織升高，而復(fù)方莪術(shù)散能夠有效抑制子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜細胞ICAM-1蛋白的表達，為治療子宮內(nèi)膜異位提供了良好的方法。

[1] 李 雷,冷金花.子宮內(nèi)膜異位癥及其治療對女性生育影響的研究進展[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2013,29(5):393-396.

[2] 黎寶珍.子宮內(nèi)膜異位癥致不孕的病因及治療研究進展[J].蛇志,2014(02):216-218.

[3] Guo S W. Recurrence of endometriosis and its control[J].Hum Reprod Update,2009,15(4):441-461.

[4] 劉頌平,溫 堅.子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制研究新進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(2):291-294.

[5] 謝愷俐.VEGF、ICAM-1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達[D].鄭州大學(xué),2003.

[6] 俞而慨,程明軍,王宜生,等.軟堅散結(jié)中藥對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠內(nèi)膜黏附因子的影響[J].中醫(yī)雜志, 2009,50(1):69-72.

[7] 魏 明,曹保利,劉 筠.復(fù)方莪術(shù)散對子宮內(nèi)膜異位癥患者血清糖類癌抗原125、19-9水平及細胞周期蛋白D表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,34(08):926-930.

[8] 曹 陽,朱 焰,秦保峰,等.紅藤顆粒劑對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜黏附分子相關(guān)基因表達及血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響[J].生殖與避孕, 2011，31(2):73-81.

[9] Ryan I P, Schriock E D, Taylor R N. Isolation, characterization, and comparison of human endometrial and endometriosis cells in vitro[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1994,78(3):642-649.

[10] 李 霞,張 俊,周 春.術(shù)前復(fù)方莪術(shù)散治療對子宮內(nèi)膜異位癥患者血清學(xué)指標(biāo)及內(nèi)膜組織中相關(guān)信號通路功能的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2015,21(11):1528-1531.

[11] 張 敏,曹保利.復(fù)方莪術(shù)散對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜組織基質(zhì)金屬蛋白酶2和血管內(nèi)皮生長因子表達的影響[J].中醫(yī)雜志,2011,52(14):1225-1228.

[12] 伍海鷹，史 云，謝蓬蓬.羅氏內(nèi)異方對子宮內(nèi)膜異位癥并不孕患者腹腔細胞 ICAM-1與 IL-8含量的影響[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志.2013,21(3) :114-116.

[13] 柳 林. HLA-G,ICAM-1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及相關(guān)性研究[J] . 濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,35(4) :250-252.

[14] 劉 麗，白椿宇，李世大，等.膈下逐瘀沖劑對輸卵管炎性不孕大鼠模型 Bcl-2和ICAM -1蛋白表達的影響[J].中醫(yī)藥信息.2015,32(3) :43-45.

(收稿：2016-09-22)

The effect of compound rhizome curcumae power on intercellular adhesion molecule-1 in endometriosis

Xue Lixia.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (Tianjin 300193)

Objective:To observe the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in endometriosis and study the effect of compound rhizome curcumae power on ICAM-1. Methods :The endometriosis rat model was established and we used WB to detect the expression of ICAM-1 in different endometriosis tissues; then we collected the cells of endometriosis and cultured. The cultured endometriosis cells were treated with low, middle and high concentration of compound rhizome curcumae power and the ICAM-1 expression was detected by WB at 24h, 48h and 72h after treated. Results:WB showed that compared with normal tissues, there were significantly higher ICAM-1 expression in ectopic and eutopic endometrium tissue (P<0.05), but more higher in ectopic tissue (P<0.01). And independent sample t test showed the expression of ICAM-1 were lower in the cultured endometriosis cells treated with low, middle and high concentration of compound rhizome curcumae power. Conclusion: The expression of ICAM-1 is higher in endometriosis tissues and compound rhizome curcumae power could effectively depress the expression of ICAM-1, which gives good method for the treatment of endometriosis.

Endometriosis @Compound rhizome curcumae power Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) Animal ，Experimentation Rats

子宮內(nèi)膜異位癥 @復(fù)方莪術(shù)散 細胞間粘附因子-1 動物，實驗 大鼠

R711.71

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.01.061