李春艷，燕 鳳，張建芳，陳必良

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

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BACs-on-Beads技術(shù)對(duì)NIPT陽(yáng)性結(jié)果的診斷價(jià)值

李春艷，燕 鳳，張建芳，陳必良

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

目的 探討應(yīng)用BACs-on-Beads(BoBs)技術(shù)在無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)陽(yáng)性結(jié)果中的診斷價(jià)值。方法 對(duì)2015年1月至2016年6月因NIPT陽(yáng)性結(jié)果在西京醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行羊水穿刺的129例孕婦進(jìn)行BoBs檢測(cè)和染色體核型分析。結(jié)果 BoBs共檢出異常數(shù)80例，檢出率62.02%。其中21三體55例、18三體10例、13三體1例、性染色體異常14例(X0 3例，XXX 3例，XXY 5例，XYY 2例，X0/XY嵌合1例)，準(zhǔn)確率依次為84.62%、71.43%、14.29%、41.18%。染色體核型分析結(jié)果與BoBs結(jié)果完全一致，確證了49例NIPT假陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)論 NIPT存在一定比例的假陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性病例必須進(jìn)行進(jìn)一步產(chǎn)前診斷，BoBs技術(shù)具有快速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)，是快速確診的有效手段。

BACs-on-Beads技術(shù)；無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)；產(chǎn)前診斷；有效手段

新生兒中，21三體綜合征(唐氏綜合征)、18三體綜合征(愛(ài)德華綜合征)、13三體綜合征(帕特氏綜合征)及性染色體非整倍體疾病是最常見(jiàn)的染色體病，其中前三種的發(fā)生率分別約為1:650、1:2 000和1:5 000[1-2]。目前臨床上對(duì)于染色體病無(wú)有效的治療方法，產(chǎn)前診斷仍然是預(yù)防此類(lèi)患兒出生的主要途徑。無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)(noninvasive prenatal testing，NIPT)是近年來(lái)發(fā)展的新技術(shù)，其安全、快速、簡(jiǎn)單，可對(duì)胎兒的游離DNA進(jìn)行高通量深度測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到胎兒的遺傳信息，從而檢測(cè)染色體非整倍體疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但是該技術(shù)目前僅作為一種篩查手段，對(duì)于NIPT陽(yáng)性病例需要進(jìn)一步的產(chǎn)前診斷分析。本研究對(duì)129例NIPT結(jié)果異常的孕婦，利用BoBs和染色體核型分析技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而評(píng)價(jià)BoBs技術(shù)在NIPT陽(yáng)性結(jié)果中的診斷價(jià)值。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

2015年1月至2016年6月因NIPT陽(yáng)性結(jié)果來(lái)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心接受遺傳咨詢(xún)并進(jìn)行羊水穿刺的孕婦129例，年齡22～45歲，孕18～33周。其中21三體高風(fēng)險(xiǎn)65例，18三體高風(fēng)險(xiǎn)14例，13三體高風(fēng)險(xiǎn)7例，性染色體異常34例，其他染色體異常9例。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1羊膜腔穿刺

在超聲定位及引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺，抽取羊水30mL，20mL用于染色體核型分析，10mL用于BoBs檢測(cè)。

1.2.2染色體核型分析

20mL羊水離心后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、胰酶消化、常規(guī)染色體制片、G顯帶，每例樣本分析30個(gè)分裂相，采集3～5個(gè)核型圖。發(fā)現(xiàn)染色體異?；蚨鄳B(tài)性變異時(shí)，計(jì)數(shù)50個(gè)分裂相并適當(dāng)增加分析的核型數(shù)。

1.2.3 BoBs檢測(cè)

取10mL羊水，利用DNA提取試劑盒(QIAamp?DNA Blood Mini Kit)，按說(shuō)明書(shū)方法提取樣本基因組DNA。按照Prenatal BACs-on-BeadsTM試劑盒進(jìn)行樣本檢測(cè)，Luminex?200TM讀取信號(hào)強(qiáng)度，BoBsoft?2.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。BoBs試劑盒購(gòu)自PerkinElmer公司。

1.2.4隨訪

對(duì)因NIPT陽(yáng)性結(jié)果做羊水穿刺確診的孕婦進(jìn)行電話隨訪，隨訪其妊娠結(jié)局及孩子出生后的健康狀況。

2結(jié)果

2.1無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果與BoBs、染色體核型結(jié)果比較

在129例NIPT陽(yáng)性結(jié)果中，21三體高風(fēng)險(xiǎn)65例，18三體高風(fēng)險(xiǎn)14例，13三體高風(fēng)險(xiǎn)7例，性染色體異常34例，其他染色體異常9例，均建議行羊水穿刺，BoBs和染色體核型分析進(jìn)行確診。

129例NIPT異常病例，BoBs均檢測(cè)成功，總共檢出異常數(shù)80例，檢出率62.02%。其中21三體55例、18三體10例、13三體1例、性染色體異常14例(X0 3例，XXX 3例，XXY 5例，XYY 2例，X0/XY嵌合1例)，準(zhǔn)確率依次為84.62%、71.43%、14.29%、41.18%?？梢?jiàn)NIPT對(duì)21三體的檢測(cè)準(zhǔn)確率最高，其次是18三體、性染色體異常和13三體。此外，染色體核型分析結(jié)果與BoBs結(jié)果完全一致，確證了49例NIPT假陽(yáng)性結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 NIPT陽(yáng)性結(jié)果與BoBs、染色體核型結(jié)果比較(n)

Table 1 Comparison of results of BoBs and karyotype with positive ones of NIPT(n)

2.2隨訪結(jié)果

對(duì)129例NIPT結(jié)果異常的孕婦進(jìn)行電話隨訪發(fā)現(xiàn)，80例孕婦在得到BoBs和染色體核型分析陽(yáng)性結(jié)果后，均選擇終止妊娠。其中79例病例證實(shí)為胎兒染色體非整倍體異常，1例為XY/X0嵌合。49例假陽(yáng)性病例經(jīng)BoBs和染色體核型分析確認(rèn)結(jié)果正常后，孕婦的焦慮情緒得到緩解，選擇繼續(xù)妊娠。

3討論

3.1無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)在產(chǎn)前篩查中的定位

傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷主要通過(guò)絨毛穿刺、羊水穿刺、臍血穿刺等介入性手段獲取絨毛、羊水、臍血等胎兒細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，結(jié)果可靠，準(zhǔn)確性高，仍然是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但是侵入性的技術(shù)易造成孕婦宮內(nèi)感染、出血、流產(chǎn)等不良后果，同時(shí)染色體核型分析對(duì)操作人員技術(shù)要求高、周期長(zhǎng)、給孕婦帶來(lái)極大的心理負(fù)擔(dān)。因此，尋找一種安全、快速、高通量的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)成為優(yōu)生優(yōu)育的基本需求。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，NIPT逐漸成為產(chǎn)前篩查的新模式，比血清學(xué)篩查具有更高的特異性和敏感性，但該技術(shù)也存在一定的局限性：①孕婦本身染色體異?；蛘呓诮邮墚愺w輸血、移植手術(shù)、細(xì)胞治療等均會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；②不適合雙胎或多胎檢測(cè)；③孕周計(jì)算不準(zhǔn)，孕婦體重超標(biāo)可能導(dǎo)致胎兒游離DNA濃度降低，影響檢測(cè)[3-4]。因此，NIPT目前只作為產(chǎn)前染色體非整倍體評(píng)估的補(bǔ)充檢測(cè)，其結(jié)果不能視為診斷，異常結(jié)果必須通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)診斷確診。

3.2BoBs對(duì)無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果的診斷

本研究應(yīng)用BoBs檢測(cè)和染色體核型分析對(duì)129例NIPT陽(yáng)性病例進(jìn)行驗(yàn)證，總共檢出異常數(shù)80例，檢出率62.02%。其中21三體55例、18三體10例、13三體1例、性染色體異常14例(X0 3例，XXX 3例，XXY 5例，XYY 2例，X0/XY嵌合1例)、其他染色體異常0例，準(zhǔn)確率依次為84.62%、71.43%、14.29%、41.18%、0.00%。由此可見(jiàn)，NIPT對(duì)21三體的檢測(cè)準(zhǔn)確率最高，其次是18三體、性染色體異常和13三體，對(duì)其他染色體異常檢出最低，還存在一定的難度。此外，染色體核型分析結(jié)果與BoBs結(jié)果完全一致，確證了49例NIPT假陽(yáng)性結(jié)果。本研究中NIPT對(duì)于常見(jiàn)染色體非整倍體檢測(cè)的準(zhǔn)確率低于有的文獻(xiàn)報(bào)道，可能是由于樣本量過(guò)少，但是整體趨勢(shì)不變，NIPT對(duì)于21三體的特異性、靈敏度最高[5]。與傳統(tǒng)核型分析相比，BoBs技術(shù)顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：①樣本用量少，僅需5～10mL羊水即可完成檢測(cè)；②檢測(cè)周期短，48h之內(nèi)可發(fā)報(bào)告；③高通量，92個(gè)樣本可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；④準(zhǔn)確性高，與核型結(jié)果完全一致；⑤操作簡(jiǎn)便。

綜上所述，NIPT對(duì)胎兒21、18、13號(hào)染色體非整倍體檢出率較高，但在其它染色體異常方面還需積累數(shù)據(jù)提高準(zhǔn)確率。目前可定位于近似于診斷的產(chǎn)前篩查，但不能完全替代介入性手段。NIPT的加入大大減少了孕婦不必要的羊水穿刺，緩解了一定的心理負(fù)擔(dān)?？傊?，只有多種產(chǎn)前診斷技術(shù)相互配合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，才能提高染色體病的檢出率，更好地降低出生缺陷，為孕婦帶來(lái)福音。

[1]Loane M,Morris J K,Addor M C,etal.Twenty-year trends in the prevalence of Down syndrome and other trisomies in Europe: impact of maternal age and prenatal screening[J].Eur J Hum Genet,2013,21(1):27-33.

[2]Savva G M,Walker K,Morris J K.The maternal age-specific live birth prevalence of trisomies 13 and 18 compared to trisomy 21 (Down syndrome)[J].Prenat Diagn,2010,30(1):57-64.

[3]燕鳳,陳必良,徐慧,等.無(wú)創(chuàng)DNA陽(yáng)性結(jié)果的驗(yàn)證和分析[J].中國(guó)產(chǎn)前診斷雜志(電子版),2016,8(2):19-22.

[4]滕月,劉丹,黃譜,等.NIPT應(yīng)用于胎兒非整倍體畸形診斷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)婦幼健康研究,2016,27(2):259-261.

[5]Norton M E,Wapner R J.Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy[J].N Engl J Med,2015,373(26):2582.

[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：于學(xué)文]

Prenatal diagnostic value of BACs-on-Beads technology for positive cases of noninvasive prenatal testing

LI Chun-yan, YAN Feng, ZHANG Jian-fang, CHEN Bi-liang

(Department of Obstetrics and Gynecology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Shaanxi Xi’an 710032, China)

Objective To assess the prenatal diagnostic value of BACs-on-Beads (BoBs) technology in positive cases of noninvasive prenatal testing (NIPT). Methods BoBs and chromosomal karyotyping were used for rapidly detecting amniotic fluid cells from 129 NIPT positive cases, who visited Fourth Military Medical University from January 2015 to June 2016. Results Eighty cases were found with chromosomal aneuploid abnormalities by BoBs, and the detection rate was 62.02%. Among all of the disorders, 55 cases were found with trisomy 21, 10 cases with trisomy 18, 1 case with trisomy 13, and 14 cases with sex chromosome abnormalities (3 cases of X0, 3 cases of XXX, 5 cases of XXY, 2 cases of XYY, 1 case of X0/XY) with the accuracy rate of 84.62%, 71.43%, 14.29% and 41.18%, respectively. The consistency between the results of BoBs and karyotype was extremely strong, and 49 cases of false positive NIPT were confirmed. Conclusion False positive results are found in NIPT, and positive cases need further prenatal diagnosis. BoBs is simple, convenient, accurate and high-throughput, and it is an effective method for rapid confirmed diagnosis.

BACs-on-Beads technology; noninvasive prenatal testing (NIPT); prenatal diagnosis; effective method

2016-11-07

李春艷(1990-)，女，實(shí)習(xí)研究員，碩士，主要從事產(chǎn)前診斷工作。

張建芳，副主任醫(yī)師；陳必良，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.017

R714.1

A

1673-5293(2016)12-1481-02