郭 淼 張曉鶯 李燕云

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830002)

重癥肌無力患者外周血CD4+T細(xì)胞功能的變化及相關(guān)機(jī)制

郭 淼 張曉鶯 李燕云

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830002)

目的探討重癥肌無力(MG)患者外周血CD4+T細(xì)胞功能的變化對其機(jī)制。方法抽取初治及治療病情穩(wěn)定的MG患者及同期入院進(jìn)行健康體檢者各20例的靜脈血10 ml。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定其外周血白細(xì)胞介素(IL)-17+CD4+T細(xì)胞、干擾素(IFN)-γ+CD4+T細(xì)胞、腫瘤壞死因子(TNF)-α+CD4+T細(xì)胞、IL-2+CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25highCD127-Treg細(xì)胞比例。CD4+T細(xì)胞與CD4+CD25highCD127-Treg細(xì)胞共孵育后，F(xiàn)CM術(shù)測定CD4 T細(xì)胞分泌IL-17、IFN-γ、TNF-α及IL-2變化情況。結(jié)果與對照組及治療病情穩(wěn)定的MG患者相比，初治MG患者外周血IL-17+CD4+T細(xì)胞、IFN-γ+CD4+T細(xì)胞、TNF-α+CD4+T細(xì)胞、IL-2+CD4+T細(xì)胞比例均顯著升高(P<0.05)。MG患者與HC外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對照組外周血CD4+CD25highCD127-Treg細(xì)胞可顯著抑制CD4 T細(xì)胞分泌IL-17、IFN-γ、TNF-α和IL-2，而MG患者外周血CD4+CD25highCD127-Treg細(xì)胞抑制CD4+TT細(xì)胞分分泌細(xì)胞因子的能力顯著降低。結(jié)論MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞功能的喪失，致使外周血CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致MG的發(fā)生和發(fā)展。

重癥肌無力；外周血淋巴細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

重癥肌無力(MG)是一種器官特異性的自身免疫性疾病，在大多數(shù)情況下，MG的發(fā)病原因主要是因?yàn)轶w內(nèi)大量產(chǎn)生針對骨骼肌乙酰膽堿受體(AchR)的高度特異性自身抗體〔1〕。MG自身免疫反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制目前還不清楚，但胸腺功能異常時(shí)(增生、腫瘤)可導(dǎo)致抗AchR的出現(xiàn)〔2〕；同時(shí)遺傳因素也與MG的發(fā)病密切相關(guān)〔3〕。本研究旨在探討MG患者外周血CD4 T細(xì)胞功能的變化及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1分離外周血單個(gè)核細(xì)胞 收集2015年06月至2016年12月內(nèi)科住院的初治MG患者及治療病情穩(wěn)定的MG患者各20例及同期入院進(jìn)行健康體檢者20例，將5 ml淋巴細(xì)胞分離液按1∶1的比例加入5 ml無菌采集的抗凝血中，置于15 ml離心管中，800 r/min離心15 min，吸取白膜層，放置于15 ml離心管(內(nèi)含10 ml RPMI 1640培養(yǎng)基)，600 r/min離心10 min，用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀物，再次400 r/min離心8 min，最后用含10%胎牛血清(FBS)、200 IU/ml rhIL-2 RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀物，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后制備成濃度為2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。

1.2細(xì)胞因子檢測方法 將外周血單個(gè)核細(xì)胞置于1 μg/ml CD3抗體及2 μg/ml CD 28抗體包被的48孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，加入1 μg/ml離子霉素及100 ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)刺激1 h后加入，高爾基體阻斷劑，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，收集細(xì)胞，首先進(jìn)行細(xì)胞表面分子CD4染色，然后采用0.5 ml細(xì)胞膜固定透化液重懸細(xì)胞，室溫下避光封存30 min，然后加入相應(yīng)熒光抗體〔細(xì)胞介素(Foxp3)、白細(xì)胞介素(IL)-17、干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α及IL-2〕，室溫避光30 min，0.2 ml 1%多聚甲醛固定液固定后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。CD4+T細(xì)胞與CD4+CD25highCD127-Treg細(xì)胞共孵育后細(xì)胞因子的檢測，將兩種細(xì)胞按1∶1比例置于1 μg/ml CD3抗體及2 μg/ml CD 28抗體包被的48孔板，余步驟同上。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MG患者外周血CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌能力檢測 外周血(IL)-17+CD4+T細(xì)胞、IFN-γ+CD4+T細(xì)胞、TNF-α+CD4+T細(xì)胞、IL-2+CD4+T細(xì)胞比例分別為(0.45±0.13)、(10.37±4.82)、(21.46±6.38)和(16.83±7.03)，初治MG患者分別為(1.38±0.25)、(20.50±3.93)、(33.82±5.92)和(41.58±6.03)，二者相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.13，12.94，10.27，22.14；均P<0.05)。治療病情穩(wěn)定MG患者分別為(0.69±0.19)、(14.36±2.62)、(26.35±4.17)和(29.35±4.42)，與初治MG患者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.94，9.29，11.17，18.41，均P<0.05)。

2.2MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞比例檢測 MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為(7.98±1.12)%，對照組為(7.88±1.08)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.09，P<0.05)。

2.3對照組外周血Treg功能與MG外周血CD4 Treg功能比較 對照組外周血CD4+CD25highCD127-Treg細(xì)胞與MG外周血CD4+T細(xì)胞共孵育后，IL-17+CD4+T細(xì)胞、IFN-γ+CD4+T細(xì)胞、TNF-α+CD4+T細(xì)胞、IL-2+CD4+T細(xì)胞比例分別為(0.93±0.14)、(14.20±14.20)、(14.20±4.72)和(27.85±5.38)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.14，10.89，27.19，31.11；均P<0.05)。

3 討 論

本研究提示，CD4+T細(xì)胞功能的異常可能與MG的發(fā)病密切相關(guān)。然而，外周血CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌能力的增強(qiáng)可能是因?yàn)镃D4+Treg細(xì)胞的免疫抑制功能降低所致。目前，Treg細(xì)胞在MG發(fā)病中的作用已得到肯定〔4～6〕。因此認(rèn)為可能是在MG患者外周血中Foxp3+CD4+Treg細(xì)胞失去了抑制CD4+T細(xì)胞的能力，致使CD4+T細(xì)胞分泌大量的炎性因子，最終導(dǎo)致MG的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，MG患者外周血CD4+CD25highCD127-Treg細(xì)胞功能的喪失，致使外周血CD4+T細(xì)胞比例升高，分泌細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α的能力增強(qiáng)，導(dǎo)致炎癥擴(kuò)張，在重癥肌無力的發(fā)生過程中起到重要作用。

1Meriggioli MN,Sanders DB.Autoimmune myasthenia gravis:emerging clinical and biological heterogeneity〔J〕.Lancet Neurol,2009;8(5):475-90.

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3Landoure G,Knight MA,Stanescu H,etal.A candidate gene for autoimmune myasthenia gravis〔J〕.Neurology,2012;79(4):342-7.

4Thiruppathi M,Rowin J,Li Jiang Q,etal.Functional defect in regulatory T cells in myasthenia gravis〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2012;1274:68-76.

5Zhang Y,Wang HB,Chi LJ,etal.The role of FoxP3+CD4+CD25hi Tregs in the pathogenesis of myasthenia gravis〔J〕.Immunol Lett,2009;122(1):52-7.

6Sakuma H,Katayama A,Saito Y,etal.CD4+ CD25(high)regulatory T cell in childhood ocular myasthenia gravis〔J〕.Brain Dev,2011;33(5):442-4.

李燕云(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科研究。

郭 淼(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事眩暈的診治研究。

R746.1

A

1005-9202(2017)20-5011-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.024

〔2017-05-09修回〕

(編輯 袁左鳴)