王改鳳 張社峰 王偉民

(河南省中醫(yī)院腦病科，河南 鄭州 450000)

三七治療局灶性缺血性腦梗死模型小鼠的療效及機制

王改鳳 張社峰 王偉民

(河南省中醫(yī)院腦病科，河南 鄭州 450000)

目的觀察三七對腦梗死模型小鼠的影響，探討作用機制。方法將50只SD小鼠隨機分成正常組、模型組、三七高劑量組、三七低劑量組和西藥組。通過線栓法構建小鼠腦梗死模型。成模后，治療組開始三七溶液灌胃給藥12 w。N 組和 CT 組給予等體積的生理鹽水溶液。給藥結束后觀察空腹血糖、肝、腎臟器系數(shù)、血清中白細胞介素(IL)-18、腫瘤壞死因子(TNF)-α以及腦組織中超氧化酶歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等相關指標的含量，并通過實時定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)檢測Bcl-2、Bax mRNA水平。結果三七高劑量組及西藥組空腹血糖比模型組有顯著下降，而且三七治療組及西藥組均可升高Bcl-2的表達、下調Bax mRNA的表達(P<0.05,P<0.01)。結論三七可能通過升高Bcl-2的表達、下調Bax mRNA的表達，從而減輕局灶性缺血性小鼠腦梗死。

三七；局灶性缺血性腦梗死；Bcl-2

在缺血性腦梗死的病理機制中，炎癥氧化應激反應導致的腦損傷作用非常明顯〔1，2〕。然而，到目前為止醫(yī)療科學界對局灶性缺血腦梗死還沒有高效無害的治療措施。本研究采用局灶性缺血性腦梗死模型小鼠觀察三七的療效及其對Bcl-2及Bax基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 三七(西安天瑞有限公司);Trizol (生工生物技術有限公司)；Bcl-2及Bax 引物 (生工生物科技有限公司)；血糖試劑盒，南京建成生物工程研究所，白細胞介素(IL)-18、腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。酶標儀，北京瑞利分析儀器公司。PCR儀(Thermo賽默飛世爾科技公司,美國)；電子天平，上海精天電子儀器有公司。

1.2實驗動物 購自廣東省實驗動物中心，SPF級C57/BL小鼠50只,體重22～25 g。將小鼠用水合氯醛麻醉后造模:小鼠麻醉后仰臥位固定，由小鼠的頸正中切口，分離左側頸總動脈及頸外動脈和頸內動脈，隨后結扎并分離頸外動脈主干，在頸外動脈游離段上剪開一小口，將預先制備好的尼龍線栓子插入，經(jīng)頸總動脈分支處通過頸內動脈入顱，至大腦前動脈首端，尼龍線插入深度平均為(18.5±0.5)mm，保持30 min。成模標準：左側肢體疼痛回縮遲鈍或消失；倒懸時左上肢向胸前屈曲；行走時身體向左側傾倒或向左轉圈；右側出現(xiàn)Honer征。隨后將成模小鼠隨機分為模型組與三七高、低劑量給藥組、西藥組各10只。均飼養(yǎng)在SPF級動物房中，自由飲用純凈水。給藥方法:三七高、低劑量組中，每只小鼠分別按150、75 mg·kg-1·d-1灌胃三七溶液，西藥組給予阿司匹林混懸液15 mg·kg-1·d-1。模型組和正常組均灌服等體積生理鹽水,連續(xù)10 w。

1.3腦組織含水量測定 用10%水合氯醛麻醉小鼠，固定小鼠頭部，去除額極，取病變的腦組織用于腦含水量測定。(1)將腦組織取出后立即稱重，即得濕重M1；(2)將腦組織放入95℃烤箱內烘24 h后取出稱重，即得干重M2；(3)含水量即(M1-M2)/M1×100%。

1.4血清IL-18、TNF-α水平檢測 小鼠禁食12 h，用10%水合氯醛麻醉小鼠后，眼底靜脈叢取血后，室溫靜置30 min,分離血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-18、TNF-α水平。

1.5腦組織中超氧化酶歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的含量 用10%水合氯醛麻醉小鼠，固定小鼠頭部，去除額極，后取病變的腦組織,加入適量PBS勻漿后，按照ELISA試劑盒說明書進行SOD、CAT水平檢測。

1.6實時定量聚合酶鏈反應 將腦組織加入Trizol中勻漿，每1 ml Trizol 加入 0.2 ml三氯甲烷；劇烈混合30 s后， 4℃ 12 000 r/min離心10 min，將水相層液體小心轉移至新的離心管中；然后加入 0.5 ml異丙醇，混合均勻，室溫靜置10 min；隨后4℃，12 000 r/min離心10 min，可見少量RNA沉淀；吸棄上清溶液，用75%乙醇洗滌沉淀2次；4℃ 7 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清，空氣中干燥 RNA 沉淀，用DEPC 水溶解 RNA 沉淀；取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測定RNA純度及濃度；計算總RNA濃度。將溶解后的RNA按試劑盒說明書進行逆轉錄及擴增。引物：Bcl-2前向：5'GGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGA3',反向：5'Reverse primer TGCACAGCGGGCATTGGGTTG3';Bax前向：5'Forward primer TGGTTGCCCTCTTCTACTTTGC3'反向：5'Reverse primer CCAGTGTCCAGCCCATGATG3',β-actin反向：5'CTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAA3'反向5'TGAAGCTGTAGCCACGCTCGGTC3'，擴增條件：95℃，2 min；95℃，5 s，60℃，32 s，共40個循環(huán)。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS10.0軟件。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1三七對局灶性缺血性腦梗死小鼠空腹血糖的影響 與正常組(6.8 mmol/L)相比，模型組小鼠空腹血糖(12.3 mmol/L)明顯增高(P<0.01)。三七高、低劑量給藥組(7.5、8.1 mmol/L)，西藥組(5.8 mmol/L)小鼠與模型組比較空腹血糖明顯下降,且三七高劑量組及西藥組小鼠血糖下降更明顯(P<0.01 或P<0.05)。

2.2三七對局灶性缺血性腦梗死小鼠肝、腎臟器系數(shù)的影響 與正常組(4.2)相比，模型組小鼠肝臟系數(shù)(3.9)有所下降(P<0.05)。三七高、低劑量給藥組(3.8、3.8)、西藥組(3.9)小鼠與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，提示三七及阿司匹林對小鼠無肝毒性影響。與正常組(5.5)相比，模型組(5.1)小鼠腎系數(shù)無顯著差異(P>0.05)，而且通過三七低、高劑量(5.1、5.2)、阿司匹林(4.1)給藥后，與模型組比較仍無顯著差異(P>0.05)，提示三七及阿司匹林對小鼠無腎毒性影響。

2.3三七對局灶性缺血性腦梗死小鼠腦組織含水量的影響 模型組(0.81)小鼠腦組織中含水量較正常組(0.61)明顯增加(P<0.01)，三七高劑量組(0.78)及西藥組(0.68)小鼠腦組織含水量顯著下降(P<0.05)，但三七低劑量組(0.82)與模型組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.4三七對局灶性缺血性腦梗死小鼠血清IL-1β、TNF-α的影響 模型組血清IL-1β(72)、TNF-α(161)水平較正常組(32、70)明顯上升(P<0.01)，高劑量三七及阿司匹林干預后能顯著下調積血清IL-1β(50、48)、TNF-α(109、98)水平(P<0.01或P<0.05)，但三七低劑量組(71、151)與模型組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.5三七對局灶性缺血性腦梗死小鼠SOD、CAT的影響 與正常組(2.9)相比，模型組(6.0)小鼠CAT水平上升(P<0.01)。三七高劑量組(4.9)及西藥組(5.8)與模型組相比CAT水平下降(P<0.01或P<0.05)，但三七低劑量組(6.1)與模型組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與正常組(81)相比，模型組(47)小鼠SOD水平下降(P<0.01)。三七高劑量組(59)及西藥組(78)與模型組相比，血清中SOD水平上升(P<0.01或P<0.05)，但三七低劑量組(53)與模型組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.6三七對局灶性缺血性腦梗死小鼠Bcl-2、Bax mRNA表達水平的調節(jié) 模型組腦組織Bcl-2、Bax mRNA表達水平(2.0，1.8)較正常組(0.6，0.5)明顯上升(P<0.01)，三七高、低劑量及阿司匹林干預后能顯著下調Bcl-2、Bax mRNA表達(0.8，1.4，0.8；0.8，1.2，0.7)，且三七高劑量組下調作用更顯著(P<0.01或P<0.05)。

3 討 論

腦梗死是由于機體血管狹窄或閉塞或者血供應不足而導致局部腦組織的缺血性壞死。大部分學者認為其發(fā)病機制主要是存在損傷級聯(lián)反應，其中主要包括炎癥、凋亡、氧化應激等，這些因素相互關聯(lián)，密不可分，從而形成了一個緊密聯(lián)系的調控體系，通過內環(huán)境一系列活動，導致神經(jīng)細胞凋亡或者死亡〔3～5〕。在局灶性腦缺血損傷的機制中，炎癥反應、氧化應激反應在各項研究中都非?；钴S；其中有大量數(shù)據(jù)表明繼發(fā)性腦損傷后機體內會釋放大量炎性因子，而這些炎癥因子正是致使血腦屏障損傷的重要因素〔6〕。

近年有大量研究表明，小鼠體內敲除了Bcl-2后，其神經(jīng)元氧化蛋白的水平被顯著上調，同時會發(fā)生各種氧化應激反應〔7～9〕。這些結果表明，Bcl-2缺失會導致細胞發(fā)生嚴重的氧化損傷，使細胞抗氧化能力下降。三七及阿司匹林可以下調局灶性缺血性腦梗死小鼠Bcl-2、Bax mRNA表達。

炎癥在缺血后的繼發(fā)性損傷中發(fā)揮很大的作用。因此，減輕病患的炎癥損傷是治療腦缺血的重要手段。單核巨噬細胞被激活后，會分泌產(chǎn)生大量的細胞因子，其中包括TNF-α。有實驗表明，TNF-α 被TNF 結合蛋白抑制劑阻斷后，實驗小鼠的腦梗死體積明顯縮小〔10,11〕。IL-1主要由 Th2 細胞分泌，其家族主要包括 IL-1α、IL-1Ra、IL-1β等。目前的研究表明其可能是通過調節(jié)相關炎性細胞因子減輕局灶性腦缺血損傷，而且具有明顯的抗炎效果，與腦缺血損傷后神經(jīng)元的修復過程密切相關〔12,13〕。本實驗提示三七治療局灶性缺血性腦梗死小鼠，可能通過抗炎作用，修復小鼠腦缺血損傷后的神經(jīng)元。

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河南省中醫(yī)藥科學研究專項課題(2015zy2023)

王改鳳(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結合治療腦血管病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性、感染及錐體外系等疾病的研究。

R743

A

1005-9202(2017)20-4997-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.018

〔2017-01-11修回〕

(編輯 徐 杰)