蔡玉梅， 朱世澤， 楊維群， 潘明孟， 王朝陽， 吳文藝

(1泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理學(xué)教研室， 2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形外科，福建 泉州 362000)

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RNA干擾敲低GSK-3β對瘢痕疙瘩形成影響的體外研究*

蔡玉梅1， 朱世澤2△， 楊維群1， 潘明孟2， 王朝陽2， 吳文藝2

(1泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室，2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形外科，福建 泉州 362000)

目的： 利用RNA干擾技術(shù)探討糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)對人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts，KFB)的抑制效果。方法: 將針對人GSK-3β基因設(shè)計(jì)合成的3對特異性小干擾RNA(siRNA)分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人KFB，通過RT-PCR和Western blot篩選出干擾人KFBGSK-3β基因表達(dá)的最佳siRNA，進(jìn)而轉(zhuǎn)染人KFB，并用RT-PCR和Western blot檢測GSK-3β及相關(guān)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果: 1434序列具有最佳的GSK-3β mRNA和蛋白抑制效率。轉(zhuǎn)染GSK-3βsiRNA后，KFB的β-catenin、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降，KFB活力下降，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞生長受抑制程度增大，細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延遲。結(jié)論: 轉(zhuǎn)染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低該基因在KFB內(nèi)的表達(dá)，從而抑制了瘢痕疙瘩生長，具有潛在的治療前景。

糖原合成酶激酶3β； 瘢痕疙瘩； 成纖維細(xì)胞； RNA干擾

瘢痕疙瘩(keloid)是一種具有浸潤生長特性的病理性瘢痕，治療后復(fù)發(fā)率高，對該病的有效預(yù)防和治療一直是整形外科界迫于解決的難題。瘢痕疙瘩組織學(xué)特點(diǎn)為大量成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度沉積，以Ⅰ、Ⅲ型膠原過度沉積為主，膠原纖維排列紊亂，從而導(dǎo)致真皮纖維化[1]。成纖維細(xì)胞是瘢痕疙瘩形成與增生的效應(yīng)細(xì)胞。

糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種保守絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于所有真核生物組織中[2]。GSK-3β最初被發(fā)現(xiàn)是參與糖原代謝的關(guān)鍵酶，但后來發(fā)現(xiàn)GSK-3β廣泛參與各種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，包括代謝調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)及細(xì)胞骨架完整性的維持，也可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和活化，并增加膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成[3]。我們在體外研究轉(zhuǎn)染靶向GSK-3β的siRNA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長可能產(chǎn)生的影響，以期為Wnt信號通路中不同基因靶點(diǎn)和高特異性基因藥物的開發(fā)、瘢痕疙瘩的分子診斷及治療提供一個(gè)新的研究領(lǐng)域。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 標(biāo)本來源 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形外科，取材部位為面部、胸背部、腹部或四肢等。由于受標(biāo)本例數(shù)限制，瘢痕疙瘩10例，其中男4例，女6例，年齡2～55歲，平均年齡(30.00±18.83)歲，病程6～24月，平均(13.70±6.31)月，病因?yàn)橥鈧?例，手術(shù)3例，穿耳孔1例，感染2例。所取標(biāo)本之患者無合并皮膚疾病、結(jié)締組織病和其它重要臟器器質(zhì)性疾病，局部皮膚無潰瘍及感染；正常皮膚10例(取自瘢痕疙瘩周圍的正常皮膚或植皮患者取皮區(qū)的正常皮膚)，所有取材均獲得患者知情同意；所有標(biāo)本均根據(jù)臨床和病理(HE染色切片的組織學(xué)檢查)診斷證實(shí)。

1.2 試劑和儀器 改良型1640培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco)；Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；siRNA(Gene-pharma)；TRIzol 試劑(Invitrogen)；抗Wnt2抗體(1∶200)、抗β-catenin抗體(1∶200)、抗p-GSK-3β抗體(1∶200)和抗cyclin D1抗體(1∶200)均購自Santa Cruz；抗GSK-3β抗體(1∶500)(Ptglab)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔、小鼠IgG(1∶2 000)(Jackson)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑和M-PER蛋白提取試劑(Pierce)；PVDF膜(Millipore)；實(shí)時(shí)熒光定量通用試劑(上海吉瑪公司)。生物安全柜(上海上凈凈化設(shè)備有限公司)；熒光顯微鏡(Motic)； MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Stratagene)；PowerPacTMHC電泳儀(Bio-Rad)；VE-180 垂直電泳槽(上海天能)；DY-B1 脫色搖床 (上海滬西儀器)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 組織塊貼壁法培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔3～5 d換液1次。實(shí)驗(yàn)取第3～6代成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白(blank)組、正常皮膚細(xì)胞(normal skin cell， normal)組、陰性對照(negative control， NC)組、無義序列siRNA轉(zhuǎn)染(scramble siRNA transfection， scramble)組和siRNA轉(zhuǎn)染組。

2.2 siRNA的設(shè)計(jì)、合成和篩選 根據(jù)Elbashir的設(shè)計(jì)原則，查找人GSK-3β基因序列(NM_019178)并設(shè)計(jì)3個(gè)siRNA序列(根據(jù)靶序列起始位置命名為siRNA1434、siRNA1814和siRNA2012)，見表1，由上海吉瑪制藥有限公司合成，序列經(jīng)BLAST查詢，排除與其它基因同源。并通過RT-qPCR和Western blot檢測不同序列具有的GSK-3β mRNA和蛋白抑制效率。

表1 siRNA序列

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染率觀察 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞常規(guī)消化后，制成單細(xì)胞懸液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋至1.5×109/L，然后接種 6 孔板，混勻后于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h。 每一A260siRNA用150 μL DEPC-H2O溶解，終濃度約為20 μmol/L。 在1.5 mL EP管中加入250 μL Opti-MEM I，再加入8 μL siRNA，取另一個(gè)1.5 mL EP管，加入250 μL Opti-MEM I，加入5 μL Lipofectamine 2000，混勻，室溫放置5 min后將兩管混合，室溫靜置25 min。吸去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL無血清的改良型1640培養(yǎng)液。 將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入6孔板中，混勻后，在培養(yǎng)箱中溫育4～6 h。吸棄轉(zhuǎn)染液，加入1.5 mL含10% FBS 的改良型1640培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。細(xì)胞轉(zhuǎn)染率(%)=轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.4 RT-PCR測定mRNA 的表達(dá) 從細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，cDNA直接用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)合成的β-catenin、Wnt2、GSK-3β和cyclin D1引物序列見表2。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,每個(gè)基因每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

表2 RT-PCR的引物序列

2.5 Western blot檢測蛋白 提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白電泳，電轉(zhuǎn)儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。分別加入相應(yīng)的I抗和II抗?；瘜W(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)顯影、定影后，膠片用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，使用Gel-Pro Analyzer軟件分析處理β-catenin、Wnt2、GSK-3β和cyclin D1的蛋白表達(dá)情況，每個(gè)基因每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

2.6 CCK-8檢測細(xì)胞活力 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞常規(guī)消化后接種于96孔板，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，分別于轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h，傾去培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)基100 μL，每孔避光加入CCK-8試劑 10 μL，避光培養(yǎng)2.5 h，酶標(biāo)儀450 nm波長測吸光度(A)值，每個(gè)基因每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siRNA轉(zhuǎn)染率測定

轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率為90%，見圖1。

Figure 1.siRNA transfection efficiency (×400). The positive cells transfected with green fluorescence.

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染效率測定

2 不同GSK-3βsiRNA轉(zhuǎn)染后各細(xì)胞GSK-3β的mRNA表達(dá)水平

與陰性對照組相比，siRNA1434組轉(zhuǎn)染24 h后，GSK-3β的mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，48 h時(shí)表達(dá)卻升高；siRNA1814組于24 h GSK-3β的mRNA表達(dá)升高，48 h則下降；而siRNA2012組2個(gè)時(shí)點(diǎn)均升高，見圖2。

3 不同GSK-3βsiRNA轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞GSK-3β的蛋白表達(dá)水平

siRNA1434組及正常皮膚組與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染24 h及48 h后，GSK-3β的蛋白表達(dá)均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05); siRNA1814組和siRNA2012組與陰性對照組相比，GSK-3β的蛋白表達(dá)均有下降，且48 h各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05);而空白組、無義序列siRNA轉(zhuǎn)染組與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

4 RT-PCR檢測RNA干擾后相關(guān)mRNA的表達(dá)情況

與陰性對照相比，GSK-3βsiRNA轉(zhuǎn)染組中β-catenin的mRNA表達(dá)上調(diào)，GSK-3β的mRNA表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。Wnt2和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

5 Western blot檢測RNA干擾后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

與陰性對照相比，GSK-3βsiRNA轉(zhuǎn)染組β-catenin、GSK-3β、cyclin D1、Wnt2和p-GSK-3β蛋白的表達(dá)均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖5。

6 CCK-8法檢測RNA干擾后KFB活力的變化

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染GSK-3βsiRNA導(dǎo)致KFB進(jìn)入對數(shù)生長期后生長減慢，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞生長受抑制程度增大，細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延遲，見圖6。

Figure 2.After transfection with differentGSK-3βsiRNAs, the mRNA expression of GSK-3β in different groups was detected by RT-PCR. ACTB: β-actin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖2 不同GSK-3βsiRNA轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞GSK-3β的mRNA表達(dá)水平

Figure 3.After transfection with differentGSK-3βsiRNAs, the protein expression of GSK-3β in different groups was detected by Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖3 不同GSK-3βsiRNA轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞GSK-3β的蛋白表達(dá)水平

Figure 4.After transfection withGSK-3βsiRNA, the mRNA expression of Wnt2, β-catenin, GSK-3β and cyclin D1 in different groups was detected by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖4 轉(zhuǎn)染GSK-3βsiRNA后不同細(xì)胞組中相關(guān)mRNA的表達(dá)水平

討 論

GSK-3β是細(xì)胞內(nèi)主要的絲氨酸/蘇氨酸家族激酶。GSK-3β基因的編碼產(chǎn)物是含433個(gè)氨基酸殘基和3個(gè)結(jié)構(gòu)域的多功能激酶，ATP綁定在其肽鏈 N端，由7個(gè)反向平行的β折疊構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu)和α螺旋之間，而 Arg96、Arg180 和 Lys205 3個(gè)帶正電的氨基酸組成的口袋結(jié)構(gòu)為底物結(jié)合的核心位點(diǎn)，通過調(diào)控多種底物，成為眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的匯聚點(diǎn)，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞分化與凋亡、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與黏附及炎癥反應(yīng)等多種生理過程，其活性異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。

本研究通過針對人GSK-3β基因設(shè)計(jì)合成特異性siRNA片段1434序列，此序列具有最佳GSK-3β的mRNA和蛋白抑制效率，同時(shí)設(shè)置含無關(guān)序列的隨機(jī)片段作為對照。轉(zhuǎn)染GSK-3βsiRNA后，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示KFB進(jìn)入對數(shù)生長期后細(xì)胞活力下降，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞生長受抑制程度增大，細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延遲。目前發(fā)現(xiàn)GSK-3β參與調(diào)節(jié)的信號通路主要有2條。(1)PI3K-AKT-GSK3β 信號通路：正常情況下，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)被激活后，進(jìn)而活化蛋白激酶B(protein kinase B，PKB;又稱AKT),活化的 AKT 與GSK-3β結(jié)合后,誘導(dǎo)GSK-3β向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,使GSK-3β失活,進(jìn)而影響GSK-3β下游底物，最終發(fā)揮其參與細(xì)胞增殖與分化及調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)的作用[5]。同時(shí)，也有研究表明當(dāng)GSK-3β上游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子受到抑制導(dǎo)致GSK-3β激活時(shí)，就會(huì)促進(jìn)caspase家族的蛋白酶激活，降低核蛋白的分解與DNA鏈的剪裂，而造成細(xì)胞凋亡[6]。(2)Wnt 信號通路：Wnt信號通路參與并影響人體的胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)鍵的生理、病理過程，而且在出生后機(jī)體的損傷與修復(fù)方面也起著重要作用[7]，GSK-3β是Wnt經(jīng)典通路的關(guān)鍵成員。創(chuàng)傷等誘因激活Wnt蛋白表達(dá)分泌，活化了胞質(zhì)內(nèi)的散亂蛋白(Dishevelled，DSH or DVL)，使β-catenin不被GSK-3β磷酸化從而避免了泛素蛋白酶體對其識別和降解，進(jìn)而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚，當(dāng)β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚到一定濃度時(shí)，就移向胞核并與胞核內(nèi)的T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相結(jié)合，激活下游cyclin D1、c-myc、c-fos等靶基因轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[8-9]。有研究表明在臨床腫瘤樣本中普遍檢測出GSK-3β的過度表達(dá)與活化，無論是化學(xué)性抑制劑介導(dǎo)的GSK-3β活性下調(diào)，還是RNA干擾介導(dǎo)的表達(dá)沉默均導(dǎo)致腫瘤明顯的生長抑制[10-11]。瘢痕疙瘩具有腫瘤的某些生物學(xué)特性，在細(xì)胞學(xué)上以細(xì)胞增生為主，劉歡等[12]也證實(shí)在瘢痕疙瘩中GSK-3β高表達(dá)，所以通過GSK-3βsiRNA片段抑制扮演“促瘤因子”角色的GSK-3β，使得PI3K-AKT-GSK3β 信號通路受阻，最終阻礙其發(fā)揮參與細(xì)胞增殖的作用。另一方面GSK-3β在 Wnt 信號通路中充當(dāng)了“腫瘤抑制因子”的功能，胞質(zhì)中的GSK-3β作為β-catenin 降解復(fù)合物中的開關(guān)分子，通過磷酸化β-catenin及泛素連接酶β-TrCP介導(dǎo)的泛素蛋白酶體通路，使其穩(wěn)定性下降[13]，所以GSK-3β的失活將在核內(nèi)外啟動(dòng) Wnt 信號途徑，Wnt2表達(dá)上升，但我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果又顯示KFB的p-GSK-3β和Wnt2蛋白表達(dá)下降，β-catenin和cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)下降，這可能是p-GSK-3β的水平明顯降低，增強(qiáng)了GSK-3β及其復(fù)合體對β-catenin的磷酸化，促進(jìn)了β-catenin的降解，導(dǎo)致游離β-catenin的表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致KFB從G1期向S期的阻滯，KFB生長受抑，倍增時(shí)間延長。相反的發(fā)現(xiàn)在其它研究中也有報(bào)道，在體內(nèi)乳腺組織高表達(dá)無激酶活性GSK-3β的轉(zhuǎn)基因小鼠可誘發(fā)乳腺癌并伴有β-catenin和cyclin D1的高表達(dá)[14]，這是否提示有其它途徑影響了Wnt2的蛋白表達(dá)，抑制了Wnt 信號通路，有待于以后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。總之，本研究結(jié)果表明，通過RNA干擾敲低GSK-3β，能抑制成纖維細(xì)胞的生長及活化，從而抑制了瘢痕疙瘩生成。這為 Wnt信號通路不同基因靶點(diǎn)和高特異性基因藥物的開發(fā)、瘢痕疙瘩的分子診斷及治療提供一個(gè)新的研究領(lǐng)域。

Figure 5.After transfection withGSK-3βsiRNA, the protein expression of GSK-3β, Wnt2, p-GSK-3β, β-catenin and cyclin D1 in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖5 轉(zhuǎn)染GSK-3βsiRNA后不同細(xì)胞組中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

Figure 6.The changes of cell viability after transfection withGSK-3βsiRNA in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖6 轉(zhuǎn)染GSK-3βsiRNA后各組細(xì)胞活力的變化

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of GSK-3β knockdown by RNA interference on formation of keloid in vitro

CAI Yu-mei1, ZHU Shi-ze2, YANG Wei-qun1, PAN Ming-meng2, WANG Chao-yang2, WU Wen-yi2

(1DepartmentofPathology,QuanzhouMedicalCollege,2DepartmentofOrthopedics,TheSecondAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Quanzhou362000,China.E-mail:zhusz@fjmu.edu.cn)

AIM: To study the suppressive effect of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) knockdown by RNA interference on the formation of keloid. METHODS: Human keloid fibroblasts (KFB)invitrowere transfected with 3 pairs of specificGSK-3βsmall interfering RNA (siRNA). The best siRNA to inhibit the GSK-3β expression in human KFB was screen by RT-PCR and Western blot. The expression of GSK-3β and related proteins at mRNA and protein levels in the KFB was determined by RT-PCR and Western blot.RESULTS: TheGSK-3βsiRNA1434 remarkably inhibited the expression of GSK-3β at mRNA and proteins levels in the human KFB. After transfection withGSK-3βsiRNA, the protein levels of β-catenin, p-GSK-3β, Wnt2 and cyclin D1 were all decreased. KFB growth became slow. With the extension of time, the inhibition of cell growth increased, and the cell doubling time was significantly delayed. CONCLUSION: siRNA targetingGSK-3βefficiently knocks down the expression ofGSK-3βin the human KFB, and inhibits the activation of Wnt signaling pathway, thus inhibiting the growth of keloid. GSK-3β may be a potential therapeutic target for keloid.

Glycogen synthase kinase-3β; Keloid; Fibroblasts; RNA interference

1000- 4718(2017)01- 0154- 07

2015- 11- 05

2016- 10- 14

福建省泉州市科技局重點(diǎn)資助科技項(xiàng)目(No. 2012Z70)； 福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(No. 2009-CX-21)

R363； R751

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.026

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