劉仁杰 王春鳳 王剛 陳光

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)

林蛙油活性肽對小鼠免疫功能的影響1)

劉仁杰 王春鳳 王剛 陳光

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)

以林蛙油蛋白雙酶水解超濾后獲得的2種不同分子質(zhì)量區(qū)間的活性肽BPOR1及BPOR2為試驗原料，體外通過脾淋巴細胞增殖試驗，分別加入不同劑量的BPOR1、BPOR2和ConA誘導，觀察淋巴細胞的增殖情況，體內(nèi)通過灌胃不同劑量BPOR1及BPOR2(100、300、600 mg·kg-1·d-1)30 d，以脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的變化來觀察2種活性肽對小鼠免疫器官的影響，利用流式細胞儀檢測小鼠T淋巴細胞亞群的變化情況。結果表明：BPOR1可明顯地促進小鼠脾淋巴細胞增殖，且具有對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖的協(xié)同刺激作用。2種混合肽對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比均有影響，并且都能影響小鼠CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群的分布?？梢?，林蛙油活性肽能增加小鼠的免疫能力，且BPOR1的作用效果比BPOR2明顯。

林蛙油；活性肽；免疫功能

With BPOR1 and BPOR2, two kinds of bioactive peptides from the oviductus ranae by enzymatic hydrolysis and ultrafiltration, we studied the effects of immunologic function in mice to observe the proliferation by adding different contents of ConA and BPOR1 or BPOR2 in culture of spleen lymphocytes, respectively. Then, we administrated mice intragastrically by different doses of BPOR1and BPOR2 (100, 300 and 600 mg/(kg·d)) for 30 d, and observed effect of BPOR on the immune organs by SI and TI. The change of T lymphocyte subsets were detected by flow cytometry. BPOR1 can obviously promote the proliferation of spleen lymphocytes in mice, and with ConA the synergistic effect was gained. SI and TI were influenced by BPOR1 and BPOR2, and the distribution of CD4+, CD8+and CD3+T lymphocyte subsets also were influenced. Therefore, BPOR1 and BPOR2 had the potential to enhance mice immunity, and the effect of BPOR1 was more obvious than that of BPOR2.

中國林蛙(Ranachensinensis)俗稱田雞、哈什螞等，多分布于東北三省，屬于藥、食、補于一體的珍貴蛙種。林蛙油是雌性林蛙的輸卵管，含有多種人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)，包括豐富的蛋白質(zhì)、多糖、微量元素以及維生素等[1]，具有滋陰養(yǎng)顏、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、延緩衰老、增強免疫力等作用[2]。林蛙油中蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后，可產(chǎn)生具有多種生理功能的林蛙油活性肽(BPOR)[3]。研究表明，活性肽是一種重要的生物活性物質(zhì)，可通過免疫刺激及調(diào)節(jié)微生態(tài)活性來實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能[4]。本研究中的林蛙油活性肽已經(jīng)過試驗驗證，具有抗氧化活性。為證實林蛙油活性肽的免疫活性，首先進行體外細胞培養(yǎng)，檢測不同分子質(zhì)量區(qū)間的林蛙油活性肽BPOR1(1～5 ku)及BPOR2(≥5～8 ku)對脾淋巴細胞增殖的作用效果，再通過體內(nèi)試驗進一步驗證2種林蛙油混合肽的免疫保健功效，為林蛙油功能性食品的開發(fā)利用及提高機體免疫功能保健品的創(chuàng)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6周齡昆明雄性小鼠80只，SPF級，平均體質(zhì)量(20±2)g，購自吉林大學實驗動物中心。

林蛙油取自吉林省長白山區(qū)；CD3、CD4、CD8等單克隆熒光抗體均購于BD公司。RPMI-1640細胞培養(yǎng)液、胎牛血清磷酸鹽緩沖液(PBS)、紅細胞裂解液、FACS buffer均購于BD公司。

ACCURIC6流式細胞儀，美國BD公司；ALPHA1-4 LD plus型真空冷凍干燥機，德國CHRIST公司；3K18型冷凍離心機，美國Sigma公司；超濾裝置，Millipore Labscale TFF；熒光倒置顯微鏡EVOS F1EVOS F1，美國AMG公司；Infinite200酶標儀，TECAN公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 林蛙油活性肽的制備

林蛙油蛋白分別以木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解，鈍化酶后以8 000 r·min-1離心40 min取上清，經(jīng)密理博超濾系統(tǒng)超濾、透析及Sephadex G-25葡聚糖凝膠過濾層析分離后得到BPOR1(1～5 ku)及BPOR2(≥5～8 ku)2種活性肽，凍干備用。

1.2.2 試驗動物分組和給藥

將小鼠隨機分為BPOR1和BPOR2低、中、高劑量組、對照組及細胞增殖試驗組，每組10只，分別給予100、300、600 mg·kg-1·d-1的BPOR1和BPOR2溶液，每天灌胃給藥1次，連續(xù)30 d。對照組給以蒸餾水。各組小鼠均自由飲水、攝食。

1.2.3 小鼠脾臟淋巴細胞增殖試驗

小鼠無菌取脾、制脾細胞懸液，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整脾細胞的密度為107個·mL-1，96孔細胞培養(yǎng)板中加細胞懸液100 μL·孔-1。對照組，PRMI1640培養(yǎng)液110 μL·孔-1；試驗組，PRMI1640培養(yǎng)液10 μL·孔-1+100 μL·孔-1的BPOR1或BPOR2(終質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg·L-1)，50 mg·L-1的ConA液10 μL·孔-1+100 μL·孔-1的BPOR1或BPOR2(終質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg·L-1)；ConA誘導組，PRMI1640培養(yǎng)液100 μL·孔-1+50 mg·L-1的ConA液10 μL·孔-1。每個處理6個平行，混勻后置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h，輕吸棄上清100 μL·孔-1，加MTT液40 μL·孔-1并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加DMSO 150 μL·孔-1，振蕩混勻2 min，靜置20 min，酶標儀570 nm測OD值。

1.2.4 林蛙油活性肽對小鼠免疫器官臟體比的影響

小鼠飼喂30 d后，稱質(zhì)量，處死，取其脾和胸腺，吸干表面血污，稱質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。按照公式(1)和(2)進行計算。對各劑量組結果與對照組進行方差分析。

脾臟指數(shù)=(脾質(zhì)量/體質(zhì)量)×10。

(1)

胸腺指數(shù)=(胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量)×10。

(2)

1.2.5 流式細胞儀檢測小鼠T淋巴細胞亞群

連續(xù)灌胃30 d，小鼠眼球采血后頸椎脫臼處死，無菌取小鼠脾臟，制取脾淋巴細胞單細胞懸液，計數(shù)、調(diào)整細胞密度至106個·mL-1；將上述單細胞懸液分管，每管加入10 μL CD3、CD4和CD8熒光表面抗體，充分混勻，4 ℃避光孵育1 h后，每管加入1 mL FACS buffer，4 ℃，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清；以用150 μL FACS buffer輕輕地重懸細胞沉淀；將細胞液用70 μm尼龍膜過濾轉(zhuǎn)移至流式管中，上機檢測。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

利用CELLQUEST軟件分析流式細胞儀上獲取的數(shù)據(jù)，CD3+，CD4+和CD8+T淋巴細胞分別以其占T淋巴細胞的比例計算，軟件SPSS 18對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 小鼠脾淋巴細胞增殖情況

按照分組方案培養(yǎng)脾淋巴細胞至40 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞的增殖情況，結果如圖1所示。各組脾淋巴細胞的增殖情況差異明顯。與對照組相比，ConA陽性對照組的脾淋巴細胞明顯增加，而ConA+BPOR1(60 mg·L-1)協(xié)同刺激組淋母細胞數(shù)量明顯多于ConA陽性對照組。

a.對照組；b.ConA刺激組；c.ConA+BPOR1(60 mg·L-1)協(xié)同刺激；d.ConA+BPOR2(60 mg·L-1)協(xié)同刺激。

圖1 小鼠脾淋巴細胞不同刺激物培養(yǎng)40 h的結果

通過MTT法檢測各組脾淋巴細胞的增殖情況，結果以吸光度值衡量。由表1可知：在無ConA刺激下，與對照組相比，40～100 mg·L-1的BPOR1均能明顯地促進小鼠脾淋巴細胞增殖，而BPOR2各劑量組效果不明顯。在ConA刺激下，20～100 mg·L-1的BPOR1和ConA聯(lián)合作用誘導的淋巴細胞增殖顯著，且60 mg·L-1的刺激效果最好。BPOR2組中僅20 mg·L-1劑量作用下，ConA誘導的淋巴細胞增殖顯著高于對照組，其他各劑量組作用效果不明顯。表明BPOR1對脾淋巴細胞的增殖效果比BPOR2明顯，且BPOR1具有對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖的協(xié)同刺激作用。

表1 BPOR1和BPOR2對脾淋巴細胞增殖能力的影響(n=6)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；*為差異顯著(P<0.05)，** 為差異極顯著(P<0.01)。

脾臟淋巴細胞是機體的免疫活性細胞，其增殖是反映細胞免疫最直接的指標。本研究發(fā)現(xiàn)，BPOR1對小鼠淋巴細胞的促增殖作用顯著，與ConA協(xié)同作效果更加明顯。可能是由于BPOR1中主要成分為小分子活性肽，在淋巴細胞增殖中作為致有絲分裂原促進DNA的復制、蛋白的翻譯表達、多酶系統(tǒng)的合成分泌等直接提供營養(yǎng)和能量需求，具有促進淋巴細胞增殖的作用，對增強機體的免疫功能具有重要的意義[5]。

2.2 免疫器官臟/體比

以2種的林蛙油活性肽BPOR1和BPOR2為原料來研究對小鼠免疫器官的影響。小鼠灌胃結束后，按照臟體比測定方法及公式(1)和(2)計算給藥30 d后的臟體比，結果見表2。由表2可知，2種林蛙油活性肽對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有影響。BPOR1 3個劑量組的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均高于對照組，且呈現(xiàn)一定的劑量效應關系，高劑量組的脾臟指數(shù)與對照組差異顯著(P=0.048)，其胸腺指數(shù)與對照組存在顯著性差異(P=0.045)。BPOR2組中只有低劑量組的脾臟指數(shù)略高于空白對照組，其他中、高劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均低于對照組，各組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 BPOR1和BPOR2對小鼠免疫器官質(zhì)量的影響(n=10)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；*為差異顯著(P<0.05)。

生物體內(nèi)細胞分化、神經(jīng)激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等均與活性肽密切相關。肽分子質(zhì)量越小，越容易通過細胞膜以原形直接進入細胞內(nèi)，直接介入新陳代謝[6]。本試驗中的BPOR1分子質(zhì)量為1～5 ku，而BPOR2分子質(zhì)量≥5～8 ku，在BPOR1中含有更為豐富的小分子活性肽。研究表明：在機體內(nèi)小分子活性肽可以修復缺損，排除細胞內(nèi)毒素，激活多種酶系統(tǒng)，具有更強的生物活性來調(diào)節(jié)靶器官的狀態(tài)及功能，活躍和增強免疫系統(tǒng)[7]。因此，本研究中2種林蛙油活性肽均能提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，且BPOR1的作用明顯優(yōu)于BPOR2。與相關研究報道[8]相符。

2.3 小鼠T淋巴細胞亞群分群

二維散點圖以雙參數(shù)確定淋巴細胞群，每個點表示一個或多個細胞。全圖劃分為4個象限，以區(qū)分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。經(jīng)不同劑量林蛙油活性肽給藥30 d后，在淋巴細胞亞群周圍通過合理的設門P，以單獨分析指定的亞群細胞[9]。如圖2所示，不同劑量林蛙油活性肽灌胃30 d后的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群均可明顯地分群。

2.4 林蛙油活性肽對小鼠T淋巴細胞亞群的影響

以BPOR1和BPOR2經(jīng)口灌胃正常小鼠30 d，以此來研究二者對小鼠T淋巴細胞亞群的影響。由表3可見，與空白對照組相比，林蛙油活性肽BPOR1和BPOR2對小鼠T淋巴細胞亞群均有一定的影響。BPOR1的3個劑量組的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值，與對照組相比，高劑量組的T淋巴細胞比例增加最大，中劑量組次之，低劑量組則最小。3個劑量組的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均高于對照組，但各組差異均無統(tǒng)計學意義，同時也不呈現(xiàn)劑量效應關系；BPOR1各組相對應的CD8+值均略低于對照組，各組差異不顯著。BPOR2的中、高劑量組的T淋巴細胞比例均高于對照組，但差異不明顯，同時2劑量組的CD8+值均高于對照組，各組間差異均無統(tǒng)計學意義(表3)。

表3 BPOR1和BPOR2對小鼠T淋巴細胞亞群的影響(n=10)

處理劑量/mg·kg-1·d-1CD3+/%CD4+/%CD8+/%(CD4+/CD8+)/%對照組 040．18±6．0452．15±4．2315．88±2．363．37±0．62BPOR110041．28±3．4652．85±6．4315．03±1．673．55±0．5130041．70±4．4953．43±2．1015．63±1．613．46±0．4460042．46±3．6754．74±7．0415．40±1．833．59±0．64BPOR210036．62±4．6751．08±6．5115．32±1．443．36±0．5230040．24±5．6052．95±4．8617．40±1．353．04±0．1460040．82±1．3253．36±5．5715．98±2．113．40±0．67

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

T淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)重要的一群細胞，具有抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用。細胞膜表面的CD3+為成熟T細胞表面標志，反映了總T淋巴細胞水平。CD4+是免疫反應的核心細胞，CD8+是免疫反應的效應細胞，CD4+、CD8+兩個亞群相互協(xié)作和制約,二者的比值維持在一定水平，達到免疫平衡，實現(xiàn)機體正常免疫功能。當CD3+、CD4+及CD4+/CD8+數(shù)量減小或CD8+數(shù)量增加則免疫失衡，反映了機體免疫能力的下降，則易引發(fā)一系列疾病[10]。因此，T淋巴細胞亞群的免疫分型能夠提供機體狀態(tài)的重要信息。

灌胃30 d不同劑量的BPOR1和BPOR2后，檢測T淋巴細胞亞群的變化情況，最終結果并沒有引起CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)量的顯著變化?？赡苁怯捎贐POR1和BPOR2被機體吸收利用后，激活脾臟多酶系統(tǒng)，參與淋巴細胞的新陳代謝，促使CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞活性增強，提高了小鼠免疫器官的功能。由于生物系統(tǒng)存在T淋巴細胞的游走、遷移和歸巢，使其在體內(nèi)處于動態(tài)循環(huán)狀態(tài)，由血液進入組織，再從組織進入血液；隨著試驗時間的增加，T淋巴細胞各亞群的平衡逐漸趨于正常[11-12]，故與空白對照組差異不顯著。試驗結果與本研究的預期相符。在此基礎上，明確BPOR1和BPOR2對免疫功能低下小鼠的作用效果及機制，尚需進一步的研究驗證。

a.空白對照淋巴細胞群的FS/SS散點圖；b.P門內(nèi)區(qū)域為加入熒光單抗后CD3+T淋巴細胞群散點圖；c.空白組小鼠T淋巴細胞亞群，十字門右下方CD4+T淋巴細胞散點圖，十字門左上方CD8+T淋巴細胞散點圖；d-f.分別為BPOR1低、中、高劑量組T淋巴細胞亞群分群情況；g-i.分別為BPOR2低、中、高劑量組T淋巴細胞亞群分群情況。

圖2 不同劑量BPOR對小鼠T淋巴細胞群影響的流式分析散點圖

3 結論

在小鼠脾淋巴細胞增殖試驗中，BPOR1可明顯地促進小鼠脾淋巴細胞增殖，且具有對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖的協(xié)同刺激作用。體內(nèi)試驗以林蛙油活性肽BPOR1及BPOR2的3個劑量組(100、300、600 mg·kg-1·d-1)分別灌胃小鼠30 d，結果表明，2種活性肽對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有影響，其中BPOR1的效果更為明顯。流式細胞術檢測BPOR1及BPOR2對正常小鼠T淋巴細胞亞群的影響，統(tǒng)計結果可見BPOR1和BPOR2都能影響小鼠T淋巴細胞亞群的分布，尤其BPOR1的3個劑量組的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均高于對照組，但與對照組差異不顯著。綜上得出：2種林蛙油活性肽均能增加小鼠脾淋巴細胞功能，提高機體免疫力，且BPOR1的作用效果比BPOR2明顯。

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Effect of Bioactive Peptides from the Oviductus Ranae on Immunologic Function of Mice//

Liu Renjie, Wang Chunfeng, Wang Gang, Chen Guang

(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(1)：82-85,89.

Oviductus ranae； Bioactive peptide； Immunity

劉仁杰，女，1974年8月生，吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，副教授。E-mail:lrjem@126.com。

陳光，吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，教授。E-mail：chg61@163.com。

2016年1月5日。

R285.5；R931.74

1)吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130303045NY)。

責任編輯：程 紅。