劉仁杰 王春鳳 王剛 陳光

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

林蛙油活性肽對(duì)小鼠免疫功能的影響1)

劉仁杰 王春鳳 王剛 陳光

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

以林蛙油蛋白雙酶水解超濾后獲得的2種不同分子質(zhì)量區(qū)間的活性肽BPOR1及BPOR2為試驗(yàn)原料，體外通過(guò)脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，分別加入不同劑量的BPOR1、BPOR2和ConA誘導(dǎo)，觀察淋巴細(xì)胞的增殖情況，體內(nèi)通過(guò)灌胃不同劑量BPOR1及BPOR2(100、300、600 mg·kg-1·d-1)30 d，以脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的變化來(lái)觀察2種活性肽對(duì)小鼠免疫器官的影響，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況。結(jié)果表明：BPOR1可明顯地促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，且具有對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的協(xié)同刺激作用。2種混合肽對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比均有影響，并且都能影響小鼠CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的分布?？梢?，林蛙油活性肽能增加小鼠的免疫能力，且BPOR1的作用效果比BPOR2明顯。

林蛙油；活性肽；免疫功能

With BPOR1 and BPOR2, two kinds of bioactive peptides from the oviductus ranae by enzymatic hydrolysis and ultrafiltration, we studied the effects of immunologic function in mice to observe the proliferation by adding different contents of ConA and BPOR1 or BPOR2 in culture of spleen lymphocytes, respectively. Then, we administrated mice intragastrically by different doses of BPOR1and BPOR2 (100, 300 and 600 mg/(kg·d)) for 30 d, and observed effect of BPOR on the immune organs by SI and TI. The change of T lymphocyte subsets were detected by flow cytometry. BPOR1 can obviously promote the proliferation of spleen lymphocytes in mice, and with ConA the synergistic effect was gained. SI and TI were influenced by BPOR1 and BPOR2, and the distribution of CD4+, CD8+and CD3+T lymphocyte subsets also were influenced. Therefore, BPOR1 and BPOR2 had the potential to enhance mice immunity, and the effect of BPOR1 was more obvious than that of BPOR2.

中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)俗稱田雞、哈什螞等，多分布于東北三省，屬于藥、食、補(bǔ)于一體的珍貴蛙種。林蛙油是雌性林蛙的輸卵管，含有多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括豐富的蛋白質(zhì)、多糖、微量元素以及維生素等[1]，具有滋陰養(yǎng)顏、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等作用[2]。林蛙油中蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后，可產(chǎn)生具有多種生理功能的林蛙油活性肽(BPOR)[3]。研究表明，活性肽是一種重要的生物活性物質(zhì)，可通過(guò)免疫刺激及調(diào)節(jié)微生態(tài)活性來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能[4]。本研究中的林蛙油活性肽已經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，具有抗氧化活性。為證實(shí)林蛙油活性肽的免疫活性，首先進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)不同分子質(zhì)量區(qū)間的林蛙油活性肽BPOR1(1～5 ku)及BPOR2(≥5～8 ku)對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的作用效果，再通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證2種林蛙油混合肽的免疫保健功效，為林蛙油功能性食品的開發(fā)利用及提高機(jī)體免疫功能保健品的創(chuàng)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6周齡昆明雄性小鼠80只，SPF級(jí)，平均體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

林蛙油取自吉林省長(zhǎng)白山區(qū)；CD3、CD4、CD8等單克隆熒光抗體均購(gòu)于BD公司。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清磷酸鹽緩沖液(PBS)、紅細(xì)胞裂解液、FACS buffer均購(gòu)于BD公司。

ACCURIC6流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；ALPHA1-4 LD plus型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST公司；3K18型冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；超濾裝置，Millipore Labscale TFF；熒光倒置顯微鏡EVOS F1EVOS F1，美國(guó)AMG公司；Infinite200酶標(biāo)儀，TECAN公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 林蛙油活性肽的制備

林蛙油蛋白分別以木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解，鈍化酶后以8 000 r·min-1離心40 min取上清，經(jīng)密理博超濾系統(tǒng)超濾、透析及Sephadex G-25葡聚糖凝膠過(guò)濾層析分離后得到BPOR1(1～5 ku)及BPOR2(≥5～8 ku)2種活性肽，凍干備用。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥

將小鼠隨機(jī)分為BPOR1和BPOR2低、中、高劑量組、對(duì)照組及細(xì)胞增殖試驗(yàn)組，每組10只，分別給予100、300、600 mg·kg-1·d-1的BPOR1和BPOR2溶液，每天灌胃給藥1次，連續(xù)30 d。對(duì)照組給以蒸餾水。各組小鼠均自由飲水、攝食。

1.2.3 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

小鼠無(wú)菌取脾、制脾細(xì)胞懸液，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整脾細(xì)胞的密度為107個(gè)·mL-1，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加細(xì)胞懸液100 μL·孔-1。對(duì)照組，PRMI1640培養(yǎng)液110 μL·孔-1；試驗(yàn)組，PRMI1640培養(yǎng)液10 μL·孔-1+100 μL·孔-1的BPOR1或BPOR2(終質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg·L-1)，50 mg·L-1的ConA液10 μL·孔-1+100 μL·孔-1的BPOR1或BPOR2(終質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg·L-1)；ConA誘導(dǎo)組，PRMI1640培養(yǎng)液100 μL·孔-1+50 mg·L-1的ConA液10 μL·孔-1。每個(gè)處理6個(gè)平行，混勻后置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h，輕吸棄上清100 μL·孔-1，加MTT液40 μL·孔-1并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加DMSO 150 μL·孔-1，振蕩混勻2 min，靜置20 min，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)OD值。

1.2.4 林蛙油活性肽對(duì)小鼠免疫器官臟體比的影響

小鼠飼喂30 d后，稱質(zhì)量，處死，取其脾和胸腺，吸干表面血污，稱質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。按照公式(1)和(2)進(jìn)行計(jì)算。對(duì)各劑量組結(jié)果與對(duì)照組進(jìn)行方差分析。

脾臟指數(shù)=(脾質(zhì)量/體質(zhì)量)×10。

(1)

胸腺指數(shù)=(胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量)×10。

(2)

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群

連續(xù)灌胃30 d，小鼠眼球采血后頸椎脫臼處死，無(wú)菌取小鼠脾臟，制取脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞密度至106個(gè)·mL-1；將上述單細(xì)胞懸液分管，每管加入10 μL CD3、CD4和CD8熒光表面抗體，充分混勻，4 ℃避光孵育1 h后，每管加入1 mL FACS buffer，4 ℃，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清；以用150 μL FACS buffer輕輕地重懸細(xì)胞沉淀；將細(xì)胞液用70 μm尼龍膜過(guò)濾轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

利用CELLQUEST軟件分析流式細(xì)胞儀上獲取的數(shù)據(jù)，CD3+，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞分別以其占T淋巴細(xì)胞的比例計(jì)算，軟件SPSS 18對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況

按照分組方案培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞至40 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖1所示。各組脾淋巴細(xì)胞的增殖情況差異明顯。與對(duì)照組相比，ConA陽(yáng)性對(duì)照組的脾淋巴細(xì)胞明顯增加，而ConA+BPOR1(60 mg·L-1)協(xié)同刺激組淋母細(xì)胞數(shù)量明顯多于ConA陽(yáng)性對(duì)照組。

a.對(duì)照組；b.ConA刺激組；c.ConA+BPOR1(60 mg·L-1)協(xié)同刺激；d.ConA+BPOR2(60 mg·L-1)協(xié)同刺激。

圖1 小鼠脾淋巴細(xì)胞不同刺激物培養(yǎng)40 h的結(jié)果

通過(guò)MTT法檢測(cè)各組脾淋巴細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果以吸光度值衡量。由表1可知：在無(wú)ConA刺激下，與對(duì)照組相比，40～100 mg·L-1的BPOR1均能明顯地促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，而BPOR2各劑量組效果不明顯。在ConA刺激下，20～100 mg·L-1的BPOR1和ConA聯(lián)合作用誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖顯著，且60 mg·L-1的刺激效果最好。BPOR2組中僅20 mg·L-1劑量作用下，ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖顯著高于對(duì)照組，其他各劑量組作用效果不明顯。表明BPOR1對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖效果比BPOR2明顯，且BPOR1具有對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的協(xié)同刺激作用。

表1 BPOR1和BPOR2對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(n=6)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；*為差異顯著(P<0.05)，** 為差異極顯著(P<0.01)。

脾臟淋巴細(xì)胞是機(jī)體的免疫活性細(xì)胞，其增殖是反映細(xì)胞免疫最直接的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，BPOR1對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的促增殖作用顯著，與ConA協(xié)同作效果更加明顯。可能是由于BPOR1中主要成分為小分子活性肽，在淋巴細(xì)胞增殖中作為致有絲分裂原促進(jìn)DNA的復(fù)制、蛋白的翻譯表達(dá)、多酶系統(tǒng)的合成分泌等直接提供營(yíng)養(yǎng)和能量需求，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用，對(duì)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能具有重要的意義[5]。

2.2 免疫器官臟/體比

以2種的林蛙油活性肽BPOR1和BPOR2為原料來(lái)研究對(duì)小鼠免疫器官的影響。小鼠灌胃結(jié)束后，按照臟體比測(cè)定方法及公式(1)和(2)計(jì)算給藥30 d后的臟體比，結(jié)果見表2。由表2可知，2種林蛙油活性肽對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有影響。BPOR1 3個(gè)劑量組的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均高于對(duì)照組，且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，高劑量組的脾臟指數(shù)與對(duì)照組差異顯著(P=0.048)，其胸腺指數(shù)與對(duì)照組存在顯著性差異(P=0.045)。BPOR2組中只有低劑量組的脾臟指數(shù)略高于空白對(duì)照組，其他中、高劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均低于對(duì)照組，各組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 BPOR1和BPOR2對(duì)小鼠免疫器官質(zhì)量的影響(n=10)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；*為差異顯著(P<0.05)。

生物體內(nèi)細(xì)胞分化、神經(jīng)激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等均與活性肽密切相關(guān)。肽分子質(zhì)量越小，越容易通過(guò)細(xì)胞膜以原形直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接介入新陳代謝[6]。本試驗(yàn)中的BPOR1分子質(zhì)量為1～5 ku，而BPOR2分子質(zhì)量≥5～8 ku，在BPOR1中含有更為豐富的小分子活性肽。研究表明：在機(jī)體內(nèi)小分子活性肽可以修復(fù)缺損，排除細(xì)胞內(nèi)毒素，激活多種酶系統(tǒng)，具有更強(qiáng)的生物活性來(lái)調(diào)節(jié)靶器官的狀態(tài)及功能，活躍和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[7]。因此，本研究中2種林蛙油活性肽均能提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，且BPOR1的作用明顯優(yōu)于BPOR2。與相關(guān)研究報(bào)道[8]相符。

2.3 小鼠T淋巴細(xì)胞亞群分群

二維散點(diǎn)圖以雙參數(shù)確定淋巴細(xì)胞群，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。全圖劃分為4個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽(yáng)性細(xì)胞以及雙陽(yáng)性細(xì)胞。經(jīng)不同劑量林蛙油活性肽給藥30 d后，在淋巴細(xì)胞亞群周圍通過(guò)合理的設(shè)門P，以單獨(dú)分析指定的亞群細(xì)胞[9]。如圖2所示，不同劑量林蛙油活性肽灌胃30 d后的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群均可明顯地分群。

2.4 林蛙油活性肽對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響

以BPOR1和BPOR2經(jīng)口灌胃正常小鼠30 d，以此來(lái)研究二者對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響。由表3可見，與空白對(duì)照組相比，林蛙油活性肽BPOR1和BPOR2對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群均有一定的影響。BPOR1的3個(gè)劑量組的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值，與對(duì)照組相比，高劑量組的T淋巴細(xì)胞比例增加最大，中劑量組次之，低劑量組則最小。3個(gè)劑量組的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均高于對(duì)照組，但各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)也不呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系；BPOR1各組相對(duì)應(yīng)的CD8+值均略低于對(duì)照組，各組差異不顯著。BPOR2的中、高劑量組的T淋巴細(xì)胞比例均高于對(duì)照組，但差異不明顯，同時(shí)2劑量組的CD8+值均高于對(duì)照組，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 BPOR1和BPOR2對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響(n=10)

處理劑量/mg·kg-1·d-1CD3+/%CD4+/%CD8+/%(CD4+/CD8+)/%對(duì)照組 040．18±6．0452．15±4．2315．88±2．363．37±0．62BPOR110041．28±3．4652．85±6．4315．03±1．673．55±0．5130041．70±4．4953．43±2．1015．63±1．613．46±0．4460042．46±3．6754．74±7．0415．40±1．833．59±0．64BPOR210036．62±4．6751．08±6．5115．32±1．443．36±0．5230040．24±5．6052．95±4．8617．40±1．353．04±0．1460040．82±1．3253．36±5．5715．98±2．113．40±0．67

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要的一群細(xì)胞，具有抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用。細(xì)胞膜表面的CD3+為成熟T細(xì)胞表面標(biāo)志，反映了總T淋巴細(xì)胞水平。CD4+是免疫反應(yīng)的核心細(xì)胞，CD8+是免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，CD4+、CD8+兩個(gè)亞群相互協(xié)作和制約,二者的比值維持在一定水平，達(dá)到免疫平衡，實(shí)現(xiàn)機(jī)體正常免疫功能。當(dāng)CD3+、CD4+及CD4+/CD8+數(shù)量減小或CD8+數(shù)量增加則免疫失衡，反映了機(jī)體免疫能力的下降，則易引發(fā)一系列疾病[10]。因此，T淋巴細(xì)胞亞群的免疫分型能夠提供機(jī)體狀態(tài)的重要信息。

灌胃30 d不同劑量的BPOR1和BPOR2后，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況，最終結(jié)果并沒(méi)有引起CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的顯著變化。可能是由于BPOR1和BPOR2被機(jī)體吸收利用后，激活脾臟多酶系統(tǒng)，參與淋巴細(xì)胞的新陳代謝，促使CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞活性增強(qiáng)，提高了小鼠免疫器官的功能。由于生物系統(tǒng)存在T淋巴細(xì)胞的游走、遷移和歸巢，使其在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)循環(huán)狀態(tài)，由血液進(jìn)入組織，再?gòu)慕M織進(jìn)入血液；隨著試驗(yàn)時(shí)間的增加，T淋巴細(xì)胞各亞群的平衡逐漸趨于正常[11-12]，故與空白對(duì)照組差異不顯著。試驗(yàn)結(jié)果與本研究的預(yù)期相符。在此基礎(chǔ)上，明確BPOR1和BPOR2對(duì)免疫功能低下小鼠的作用效果及機(jī)制，尚需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

a.空白對(duì)照淋巴細(xì)胞群的FS/SS散點(diǎn)圖；b.P門內(nèi)區(qū)域?yàn)榧尤霟晒鈫慰购驝D3+T淋巴細(xì)胞群散點(diǎn)圖；c.空白組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群，十字門右下方CD4+T淋巴細(xì)胞散點(diǎn)圖，十字門左上方CD8+T淋巴細(xì)胞散點(diǎn)圖；d-f.分別為BPOR1低、中、高劑量組T淋巴細(xì)胞亞群分群情況；g-i.分別為BPOR2低、中、高劑量組T淋巴細(xì)胞亞群分群情況。

圖2 不同劑量BPOR對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞群影響的流式分析散點(diǎn)圖

3 結(jié)論

在小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，BPOR1可明顯地促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，且具有對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的協(xié)同刺激作用。體內(nèi)試驗(yàn)以林蛙油活性肽BPOR1及BPOR2的3個(gè)劑量組(100、300、600 mg·kg-1·d-1)分別灌胃小鼠30 d，結(jié)果表明，2種活性肽對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有影響，其中BPOR1的效果更為明顯。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BPOR1及BPOR2對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見BPOR1和BPOR2都能影響小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的分布，尤其BPOR1的3個(gè)劑量組的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均高于對(duì)照組，但與對(duì)照組差異不顯著。綜上得出：2種林蛙油活性肽均能增加小鼠脾淋巴細(xì)胞功能，提高機(jī)體免疫力，且BPOR1的作用效果比BPOR2明顯。

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Effect of Bioactive Peptides from the Oviductus Ranae on Immunologic Function of Mice//

Liu Renjie, Wang Chunfeng, Wang Gang, Chen Guang

(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(1)：82-85,89.

Oviductus ranae； Bioactive peptide； Immunity

劉仁杰，女，1974年8月生，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，副教授。E-mail:lrjem@126.com。

陳光，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教授。E-mail：chg61@163.com。

2016年1月5日。

R285.5；R931.74

1)吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130303045NY)。

責(zé)任編輯：程 紅。