楊海峰 王文娟 劉樂 卜松雪 張雅喃 何麗君

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特，010019)

沙柳PNY基因克隆、生物信息學(xué)及組織特異性表達(dá)1)

楊海峰 王文娟 劉樂 卜松雪 張雅喃 何麗君

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特，010019)

為了促進(jìn)沙柳(Salixpsammophila)分子定向育種，研究了其分枝及材性發(fā)育相關(guān)遺傳機制?？寺～@得了沙柳PNY基因。研究發(fā)現(xiàn)：沙柳PNY基因編碼區(qū)全長1 446 bp，編碼481個氨基酸殘基。PNY蛋白由55.09%無規(guī)卷曲、29.73%α-螺旋及15.18%延伸鏈構(gòu)成。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白分子存在PNY蛋白典型的SKY、BELL、Homeodomain結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，沙柳與杞柳(Salixpurpurea)、毛果楊(Populustrichocarpa)的PNY基因親緣關(guān)系最近。qRT-PCR組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，PNY基因在沙柳腋芽部位表達(dá)量最高，莖、葉、頂芽、根中表達(dá)量依次降低。

沙柳；PNY基因；生物信息學(xué)；組織特異性表達(dá)

To promote the molecular breeding ofSalixpsammophila, we studied its branching and wood formation mechanism.PNYgene was cloned fromS.psammophila.PNYgene has 1 446 bp coding sequences which encodes a polypeptide of 481 amino acids, and this protein is consist of the 55.09% random coil, 29.73%α-helix and 15.18% extended strand. By the conserved domains analysis, there are conserved SKY, BELL and Homeodomain in PNY protein. By the phylogenetic analysis,PNYofS.psammophilahas closer relationship with those ofS.purpureaandP.trichocarpa. The results of qRT-PCR in different tissues ofS.psammophilashow that the highest level of thePNYexpression is in the leaf axil, and the expression levels are decreased successively in stem, leaves, apical buds and roots.

沙柳(Salixpsammophila)屬于灌木或小喬木，能夠抵御風(fēng)沙，耐一定的鹽堿，嚴(yán)寒與酷熱的條件也可生存，繁殖比較容易，萌蘗力強，是固沙造林樹種[1]。

同源異形盒基因廣泛存在于真核生物中，在其生長發(fā)育中具有重要作用[2]。該類型基因結(jié)構(gòu)包含一個約180個核苷酸高度保守的同源異形盒，可轉(zhuǎn)錄形成約60個氨基酸的同源異形結(jié)構(gòu)域(HD)。該結(jié)構(gòu)域兩端含有亮氨酸拉鏈和一個酸性激活域，可與其他結(jié)構(gòu)域形成異源二聚體，再與一個特殊靶序列相結(jié)合，即可調(diào)節(jié)特定基因。根據(jù)同源異形盒基因特點，將植物中具有同源結(jié)構(gòu)域的蛋白分為7類，分別為ZM-HOX、HAT1、HAT2、ATHB8、GL2、KNAT、BELL[3]。其中KNAT和BELL的同源異型結(jié)構(gòu)域由63個氨基酸組成，在第一、二個螺旋間插入了3個額外氨基酸殘基(P-Y-P)，所以將植物中特有的KNAT(KNOTTED-like homeodomain)基因家族和BELL(BEL1-like homeodomain)基因家族歸類為同源異形盒基因家族中的TALE(Three Amino-acid Loop Extension)亞家族[4-5]。

隸屬BELL基因家族的PENNYWISE(PNY)基因有較多別名，如BEL1-LIKEHOMEODOMAIN9(BLH9)、BELLRINGER(BLR)、REPLUMLESS、VAAMANA等[6-11]。目前，PNY基因的研究主要利用草本模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)展開。研究發(fā)現(xiàn)，PNY參與的生物過程較復(fù)雜，涉及頂端分生組織、莖、花及果實等器官的分化發(fā)育[9-16]。例如PNY與KNOTTED1-like homeobox(KNOX)家族蛋白互作調(diào)節(jié)節(jié)間、頂端分生組織、花序及心皮的發(fā)育[9，11-12]，與POUND-FOOLISH(pnf)基因共同影響著擬南芥由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)化[13]，同時對成花基因GAMOUS(AG)、BOP等基因均有抑制作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，次生誘導(dǎo)后的擬南芥突變體pny的次生木質(zhì)部更為發(fā)達(dá)[17]，這表明PNY基因在次生生長中也可能具有重要作用。因此，本研究由我國西部特有沙生灌木沙柳中克隆了PNY基因，對沙柳PNY基因進(jìn)行生物信息學(xué)以及氨基酸序列結(jié)構(gòu)的保守性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹及初步的組織特異性表達(dá)分析。本研究為木本植物中同源異形盒基因的研究提供了基礎(chǔ)資料，同時也促進(jìn)沙柳的分子育種研究，對培育枝條叢生型沙柳品系、增加土壤覆蓋面積、防止水土流失及利用沙柳生物質(zhì)能源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

沙柳為2015年春季采自內(nèi)蒙古達(dá)拉特旗國家沙柳無性系種質(zhì)資源保存庫的1年生枝條，實驗室水培至20 cm。

1.2 方法

1.2.1 沙柳RNA的提取及cDNA合成

采用QIAGEN RNeasy Plant試劑盒分別提取沙柳全株、根、莖、葉、頂芽以及腋芽部位總RNA，利用Invitrogen SuperScript Ⅳ First-Stand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 特異性引物設(shè)計及基因克隆

根據(jù)擬南芥PNY基因序列(AT5G02030)及杞柳(Salixpurpurea)基因組數(shù)據(jù)庫(Phytozome 11)比對獲得的同源序列(SapurV1A.1412s0040)，在UTR區(qū)設(shè)計特異性引物，由Thermo Fisher公司合成正向引物5′-CCCGTCCTCCTCTTCATCAAT-3′及反向引物5′-CGGAGGAACTGTGAAAATGACTG-3′，利用1.2.1反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用50 μL體系全式金公司TransStart FastPfu試劑盒進(jìn)行SpsPNY基因編碼區(qū)序列(CDS)的擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為92 ℃預(yù)變性3.0 min；92 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸7 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳，利用Takara凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，與pDONR222載體進(jìn)行置換反應(yīng)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性菌株，Thermo Fisher公司測序拼接。

1.2.3SpsPNY基因生物信息學(xué)、進(jìn)化樹及RT-qPCR分析

通過NCBI的ORF(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線軟件分析沙柳PNY基因的開放閱讀框；利用Phytozome 11數(shù)據(jù)庫搜索同源核苷酸及氨基酸序列；ExPASy(http://web.expasy.org/protscale/)在線預(yù)測親水性和疏水性；ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測等電點、分子質(zhì)量；在線軟件NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。Singal P4.1預(yù)測信號肽，http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)；T-COFFEE(http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html)進(jìn)行氨基酸多序列比對；MEME Suite(http://meme-suite.org/)進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)比對；利用MEGA6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，迭代1000次；利用在線亞細(xì)胞定位軟件LOCTREE3(https://rostlab.org/services/loctree3/result.php?)和WOLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。利用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)設(shè)計并合成PNY基因表達(dá)特異檢測正向引物5′-AATGCCGCTTCAGTTTCAGG-3′、反向引物5′-TCGTCCAAAATCTGCTGTGC-3′及內(nèi)參UBQ基因正向引物5′-AAGCCCAAGAAGATCAAGCA-3′、反向引物5′-ACCACCAG CCTTCTGGTAAA-3′。采用寶生物公司SYBR Premix Ex Taq II試劑盒對沙柳根、莖、葉、頂芽、腋芽不同組織部位在Roche lightCycler 480Ⅱ儀器進(jìn)行RT-qPCR檢測，程序設(shè)置95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,45個循環(huán)，3次重復(fù)。Excel分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙柳PNY基因的克隆及推導(dǎo)的氨基酸序列

以沙柳嫩枝cDNA為模板，用設(shè)計引物進(jìn)行沙柳PNY基因的CDS序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的CDS共1 446 bp，編碼481個氨基酸(圖1)，編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53.7 ku，理論等電點為8.58。其中絲氨酸含量最多，占整個氨基酸序列的11.0%，其次為亮氨酸，占8.7%。該氨基酸序列無硒半胱氨酸和吡咯賴氨酸。該蛋白的分子式為C2339H3674N678O722S26。預(yù)測半衰期為30 h。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為50.62，說明該蛋白不穩(wěn)定。

2.2 沙柳PNY基因編碼的蛋白疏水性

通過ProtScale在線軟件對PNY基因編碼的蛋白進(jìn)行疏水性分析。分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白第131位氨基酸為異亮氨酸，疏水性最大，分值為1.844；第16位的氨基酸為賴氨酸，分值為-3.000，親水性較好(圖2)。圖2中分值為負(fù)的氨基酸多于分值為正的氨基酸，也就是親水性大于疏水性，因此可推測該蛋白為親水蛋白。

2.3 沙柳PNY蛋白的二級結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html在線預(yù)測PNY蛋白的二級結(jié)構(gòu)。通過預(yù)測結(jié)果可知，該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲(55.09%)、α-螺旋(29.73%)、延伸鏈(15.18%)組成(圖3)。

圖1 沙柳PNY基因序列及推導(dǎo)氨基酸序列

圖2 PNY蛋白的疏水性預(yù)測

圖3 PNY的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過http://smart.embl-heidelberg.de/在線分析沙柳PNY蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。分析發(fā)現(xiàn)該蛋白包含POX結(jié)構(gòu)域和Homeodomain結(jié)構(gòu)域(圖4)。由第114到229的116個氨基酸構(gòu)成POX結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域廣泛存在于植物蛋白中，與同源異型結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子中的Homeodomain結(jié)構(gòu)域有緊密關(guān)聯(lián)，BEL1-like家族蛋白中多含有該結(jié)構(gòu)域。由第277到341的65個氨基酸構(gòu)成Homeodomain結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是識別同源異型結(jié)構(gòu)基因家族的一個重要標(biāo)志，該結(jié)構(gòu)域形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，是與DNA結(jié)合的重要區(qū)域。

圖4 PNY蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測

2.4 沙柳PNY基因的氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將沙柳PNY基因推導(dǎo)的氨基酸序列利用Blast與其他植物PNY基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示：沙柳PNY基因與杞柳(SapurV1A.1412s0040.1)、毛果楊(Populustrichocarpa、Potri.010G197300.1)、擬南芥(AT5G02030.1)、番茄(Solanumlycopersicum、Solyc09g011380.2.1)的同源性分別為99.58%、94.20%、65.10%、75.44%。

利用Clustal Omega在線軟件對以上幾種植物PNY基因的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明：它們共有5個保守序列區(qū)域(圖5)，其中保守序列區(qū)域Ⅱ內(nèi)存在SKY結(jié)構(gòu)域(虛線)，保守序列區(qū)域Ⅲ內(nèi)存在BELL結(jié)構(gòu)域(單橫線)，保守區(qū)域IV內(nèi)存在Homeodomain保守區(qū)結(jié)構(gòu)域(雙橫線)。SKY、BELL、Homeodomain結(jié)構(gòu)域均為GRAS基因家族BELL亞家族中PNY基因的典型保守區(qū)域[11，18-20]，由此可確認(rèn)，沙柳中克隆獲得的序列為PNY基因。

利用MEGA6對沙柳、杞柳(SapurV1A.1412s0040.1)、毛果楊(Potri.010G197300.1)、擬南芥(AT5G02030.1)、番茄(Solyc09g011380.2.1)、木薯(Manihotesculenta、Manes.07G122100.1)、大豆(Glycinemax、Glyma.18G189700.1)、馬鈴薯(Solanumtuberosum、PGSC0003DMT400049235)、水稻(Oryzasativa、LOC_Os01g62920.1)、高粱(Sorghumbicolor、Sobic.003G356200.1)、玉米(Zeamays、GRMZM2G154641_T01)等植物的PNY氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及保守區(qū)域分析(圖6)。由圖6A可知，該基因家族共聚類為兩大類，雙子葉植物、單子葉植物各聚為一類；雙子葉植物中沙柳、杞柳、毛果楊的親緣關(guān)系更近，它們基本一致的氨基酸序列保守區(qū)域也印證了它們更近的親緣關(guān)系(圖6B)；單子葉植物的玉米、高粱的親緣關(guān)系更近，氨基酸序列保守區(qū)域也基本一致。上述結(jié)果表明，在PNY基因的進(jìn)化中，雙子葉植物與單子葉植物具有一定的差異。楊、柳等木本植物與其他草本植物相比較，進(jìn)化差異更為明顯。

*為保守；：為次保守；I、II、III、IV、V為保守區(qū)域；虛線為SKY保守結(jié)構(gòu)域；單橫線為BELL保守結(jié)構(gòu)域；雙橫線為Homeodomain保守結(jié)構(gòu)域。

圖5 沙柳PNY氨基酸與其他植物PNY氨基酸序列比對

圖6 植物PNY基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)及保守區(qū)域

2.5 沙柳PNY基因的組織特異性表達(dá)

以前期研究篩選出來的沙柳UBQ基因為內(nèi)參，通過qRT-PCR對沙柳PNY基因在沙柳根、頂芽、葉、莖、腋芽部位的表達(dá)量進(jìn)行測定。以SpsPNY基因在根中的相對表達(dá)量(1.07E-2)為參照，頂芽、葉、莖、腋芽中的PNY基因表達(dá)量分別是根的6.64、15.13、24.16、33.98倍，其中SpsPNY基因在腋芽部位表達(dá)量最高，其次是莖、葉、頂芽，根中的表達(dá)量最低。

3 結(jié)論與討論

本研究由沙柳中克隆獲得PNY基因，該基因含有1 446 bp的CDS序列，編碼481個氨基酸。沙柳PNY基因的氨基酸序列與杞柳、毛果楊、擬南芥、番茄的同源性分別為99.58%、94.20%、65.10%、75.44%。通過對PNY氨基酸序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及保守區(qū)域分析可知，該蛋白包含PNY基因的典型保守區(qū)域SKY、BELL、Homeodomain結(jié)構(gòu)域。

由系統(tǒng)進(jìn)化樹及氨基酸序列保守區(qū)域分析可知，沙柳與杞柳、毛果楊等木本植物PNY基因親緣關(guān)系最近，與其他草本植物的親緣關(guān)系有一定差異，氨基酸序列的保守區(qū)域的分布也是木本植物間最相似，而與草本植物同樣存在明顯差異。這些差異一方面表明，木本植物與草本植物PNY基因在進(jìn)化中存在差異；另一方面表明，木本植物與草本植物的PNY基因功能可能存在一定差異。對草本植物中PNY功能的研究表明，PNY與KNOX蛋白特異結(jié)合，維持莖尖分生組織及器官分化、調(diào)節(jié)莖的節(jié)間發(fā)育、控制營養(yǎng)生長與生殖生長轉(zhuǎn)化以及花、種子的發(fā)育[7，9-16]，但未見木本植物中PNY基因功能的相關(guān)研究。木本植物中該基因的表達(dá)及調(diào)控可能更為復(fù)雜，尤其對木本植物的次生生長及木材形成極有可能存在更為緊密的聯(lián)系。

本研究通過qRT-PCR對沙柳根、莖、葉、腋芽、頂芽部位PNY基因進(jìn)行相對定量分析，發(fā)現(xiàn)SpsPNY基因在腋芽部位表達(dá)量最多，其次為莖，根中含量最少。由pny擬南芥突變體表型可知，該突變體分枝數(shù)量增加[7，17]，該突變表型與沙柳腋芽部位PNY基因的高表達(dá)量很可能是存在因果關(guān)系的。此外，SpsPNY基因在沙柳莖中表達(dá)量也較高，表明該基因還可能對維持木本植物莖的次生生長有著重要作用。本研究前期對擬南芥pny突變體莖的顯微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，該突變體莖的木質(zhì)部較野生型發(fā)達(dá)，形成層細(xì)胞活躍，韌皮部發(fā)育也較快[17]，因此推測該基因?qū)φ{(diào)控植物莖的次生生長發(fā)育有著重要作用。為進(jìn)一步證實該推測，還需采用基因敲除或超表達(dá)等研究手段，轉(zhuǎn)化木本模式植物，驗證基因功能。

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PNYGene Cloning, Bioinformatics and Tissue-specific Expression Analysis ofSalixpsammophila//

Yang Haifeng, Wang Wenjuan, Liu Le, Bu Songxue, Zhang Ya’nan, He Lijun

(Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(1)：7-12.

Salixpsammophila;PNYgene; Bioinformation; Tissue specific expression

1)國家自然科學(xué)基金項目(31360187，31660216)；林木遺傳育種國家重點實驗室(中國林業(yè)科學(xué)研究院)開放課題(TGB2015001)。

楊海峰，男，1975年12月生，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail:yang_hf888@163.com。

2016年8月2日。

S718.46

責(zé)任編輯：程 紅。