孟 鑫， 劉 瑤， 陳 瑞， 蔡 進(jìn)， 毛政益， 劉珈伲， 劉麗娜， 黃 靜*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

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大烏泡根總黃酮提取工藝優(yōu)選*

孟 鑫**， 劉 瑤， 陳 瑞， 蔡 進(jìn)， 毛政益， 劉珈伲， 劉麗娜， 黃 靜***

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

目的： 考察大烏泡根總黃酮的提取工藝。方法： 選取料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并用紫外分光光度法對(duì)大烏泡根總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果： 大烏泡根總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為料液比為1∶10，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為70 ℃；該條件下測(cè)定大烏泡根總黃酮含量為4.8%。結(jié)論： 大烏泡根總黃酮含量的測(cè)定方法簡便，準(zhǔn)確可靠，為大烏泡藥材質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。

中草藥； 植物提取物； 大烏泡； 總黃酮； 正交試驗(yàn)

大烏泡為薔薇科懸鉤子屬(RubusmultibroacteatusLevl&Vant．)，以根及全株入藥，性苦、涼，入脾、肝二經(jīng)，全國大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于四川、云南、貴州等地，具清熱解毒、祛風(fēng)除濕、涼血、止血，接骨的功效，多用于治痢疾、腹瀉、風(fēng)濕痹痛、咳血、婦女倒經(jīng)，骨折等[1-3]。目前，大烏泡已是上市中藥制劑齲齒寧中的一味重要藥材，用來治療齲齒痛，牙周炎，牙齦炎[4]。大烏泡為苗藥的常用藥，曾有其總黃酮的含量測(cè)定[5]及大烏泡抗炎活性篩選[6]的報(bào)道，并從大烏泡正丁醇部位中分離出4個(gè)黃酮類化合物[7]，黃酮類成分作為中草藥重要的活性物質(zhì)，具有抗氧化，抗炎，抗菌、抗病毒、保護(hù)心血管系統(tǒng)等方面的療效[8-10]。目前尚未見對(duì)其根部總黃酮提取工藝條件研究的報(bào)道，本研究對(duì)大烏泡根總黃酮進(jìn)行提取，通過正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)提取工藝進(jìn)行探討，同時(shí)對(duì)其總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，為臨床應(yīng)用和產(chǎn)地加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大烏泡 藥材于2013年6月采自貴州凱里市，各試驗(yàn)樣本由貴州醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬大烏泡(RubusmultibroacteatusLevl&Vant．)的干燥根。

1.1.2 儀器與試劑 UV-1750紫外分光光度計(jì)(島津儀器有限公司), DFT-200手提式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市大得中藥機(jī)械有限公司),EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司),SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司),SEF-OBR型回旋蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司),D2F-OB型真空干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品鑒定所，批號(hào)100080-200707)，其他試劑均為分析純。

1.2 大烏泡根總黃酮含量測(cè)定

1.2.1 供試品溶液的制備 取大烏泡根莖適量，用手提式高速中藥粉碎機(jī)粉碎成粉末，稱定3.0 g，回流提取,減壓濃縮(60 ℃)并定容至50 mL容量瓶中，得供試品溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]和前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大烏泡根中含有黃酮類成分蘆丁，故采用蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定其所含黃酮類成分的含量。精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入60%的乙醇溶解，定容至刻度，搖勻靜置，即得蘆丁對(duì)照品溶液。

1.2.3 測(cè)定波長的選擇 稱取蘆丁對(duì)照品2 mg，置于10 mL容量瓶中，制成0.2 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，之后采用加NaNO2-Al(NO3)3-NaOH染色法測(cè)定其最大波長，以相應(yīng)試劑為空白，在400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描以確定最大吸收波長。吸取樣品溶液0.5 mL，同樣采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測(cè)定大烏泡根中總黃酮吸收波長。最終結(jié)果顯示蘆丁與大烏泡根中總黃酮的最大吸收波長均為512 nm，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾，故選擇512 nm為最終大烏泡根總黃酮測(cè)定波長。

1.2.4 線性關(guān)系的考察 分別吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.25、0.5、1.0、1.5及2.0 mL于6只10 mL的容量瓶中，先加入5 %亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；然后加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，用60 %的乙醇稀釋至10 mL，搖勻，放置10～15 min后，在512 nm波長處測(cè)定吸光度A。以蘆丁溶液濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，分光光度法測(cè)定的吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.2.4項(xiàng)”同法操作，測(cè)定其吸光度值，并重復(fù)測(cè)定6次。

1.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取一定量某一供試品溶液6份，按“1.2.4項(xiàng)”方法進(jìn)行顯色和測(cè)定，測(cè)定其吸光度。

1.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取一定量同一供試品溶液，按“1.2.4項(xiàng)”方法進(jìn)行顯色和測(cè)定，分別在15、30、45、60、90及150 min測(cè)定其吸光度。

1.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加入已知含量的樣品，稱取樣品6份，每份約30 mg，精密稱定，按供試品溶液制備方法制成溶液6份，精密吸取供一定量供試品溶液，按“1.2.4項(xiàng)”方法測(cè)定總黃酮，計(jì)算其回收率。

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]及大生產(chǎn)實(shí)際情況，影響黃酮提取效率的主要因素為提取溶劑的種類、濃度、提取溫度與提取次數(shù)。依據(jù)黃酮的理化性質(zhì)，選擇影響提取的主要因素料液比、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、 提取溫度4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)，以總黃酮含量為考察指標(biāo)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次進(jìn)行，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 大烏泡根總黃酮提取的因素及水平Tab.1 Factors and levels of flavonoids extraction in Rubus multibracteatus Levl & Vant．

1.5 樣品黃酮含量

吸取供試品溶液0.2 mL，置于10 mL容量瓶中，參照“1.2.4項(xiàng)下”于512 nm處測(cè)定總黃酮。計(jì)算大烏泡根總黃酮含量(mg/g)=(C×V×N)/W。C為測(cè)量液總黃酮濃度(mg/mL)，N為稀釋倍數(shù)，V為粗提液體積(mL)，W為藥材干重(g)。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

以蘆丁溶液濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，分光光度法測(cè)定的吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=0.011×C-0.009,R2=0.999，表明蘆丁對(duì)照品溶液濃度為10.9～87.2 g/L ，呈良好的線性關(guān)系。

2.2 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)中，測(cè)定其吸光度值為0.405、0.403、0.416、0.394、0.395、0.401，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.41%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)中，其樣品含量為4.68%、4.82%、4.78%、4.75%、4.60%、4.79%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.33%，表明試驗(yàn)重復(fù)性好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，在15、30、45、60、90、150 min的吸光度值為0.405、0.403、0.416、0.394、0.495、0.401，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為1.41%，表明供試品在150 min內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，平均加樣回收率為99.22%，RSD值為1.02%，表明準(zhǔn)確度符合試驗(yàn)要求。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of spotting recovery

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及樣品黃酮含量

對(duì)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的9個(gè)試驗(yàn)都分別進(jìn)行3次的平行試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)提取所得的27份提取液中的總黃酮進(jìn)行測(cè)定，見表3和表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of orthogonal text

表4 正交試驗(yàn)方差分析Tab.4 ANOVA of orthogonal experiment

注：F0.05(2,18)=3.55 ，F(xiàn)0.01(2,18)=6.01(1)表示差異非常顯著,F>F0.01(2,18)

結(jié)果表明，提取時(shí)間是影響提取條件的最主要因素，料液比影響次之，由直觀分析確定并綜合經(jīng)濟(jì)性和實(shí)驗(yàn)室條件等各因素考慮，最終確定最優(yōu)方案為用料液比為1∶10，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為70 ℃。并計(jì)算大烏泡根中總黃酮含量為4.8%。

3 討論

正交試驗(yàn)法在研究藥材有效部位提取工藝中有廣泛應(yīng)用，正交試驗(yàn)可以在最短時(shí)間，最節(jié)約成本的前提下簡便有效的測(cè)定出藥用植物的最佳提取工藝。本課題亦選用正交試驗(yàn)法對(duì)大烏泡根總黃酮的乙醇提取工藝進(jìn)行篩選，以大烏泡根中總黃酮含量為指標(biāo)對(duì)其乙醇加熱回流提取工藝進(jìn)行了篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大烏泡根總黃酮的最佳提取工藝為用料液比為1∶10，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為70 ℃。大烏泡作為貴州苗族地區(qū)的常用藥，但并沒有被中國藥典收錄，本試驗(yàn)對(duì)大烏泡根中總黃酮的提取方法進(jìn)行了考察并驗(yàn)證了其方法的可靠性，為大烏泡產(chǎn)地的種植及藥用價(jià)值的開發(fā)提供依據(jù)，并為今后大烏泡質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了基礎(chǔ)。

[1] 邱德文，杜江.中華本草苗藥卷[M].貴陽：貴州科技出版社， 2005：62.

[2] 貴州省藥品監(jiān)督管理局編委.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M]．貴陽：貴州科技出版社， 2003：30.

[3] 汪毅，司曉文，夏同珩,等.中國苗族藥物彩色圖集[M].新疆：新疆科學(xué)技術(shù)出版社， 2003：57.

[4] 徐樹蕓.貴州十種民族藥的應(yīng)用研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2006(6)：73-78.

[5] 程偉，秦文杰,陳索紅,等.大烏泡葉中總黃酮含量測(cè)定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志, 2009(9)：42-43．

[6] 李天平，張彥民，李淼,等.大烏泡抗炎活性成分的篩選及GC/MS分析[N].2009年藥物分析論文匯總， 2009:221-225.

[7] 熊山.中藥楮實(shí)子及大烏泡的化學(xué)成分研究[D].貴州：貴陽中醫(yī)學(xué)院, 2009:1-3.

[8] 聶彝，余陳歡，王芳芳,等.石薺芋總黃酮抗炎作用及其機(jī)制研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2008(1)：65-66.

[9] 宣以巍，劉英，江萍,等.柑橘類黃酮的生理活性及其研究現(xiàn)狀[J].科技通報(bào)， 2008(4)：494-497.

[10]陳叢瑾，王琪，李欣.黃酮類化合物抗氧化和抑菌生物活性研究進(jìn)展[J].中國藥房， 2011(35)：3346-3348.

[11]劉文麗，余魯海，馬燕.紫外分光光度法在黃酮類化合物含量測(cè)定中的應(yīng)用[J].新疆中醫(yī)藥， 2006(3)：85-86.

[12]王向軍.兩頭毛中總黃酮提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011(13)：50-52.

[13]陳琦.正交試驗(yàn)優(yōu)化羊蹄總黃酮提取工藝[J].中國醫(yī)藥指南， 2010(25)：12-13.

[14]徐保利，管慧潔，王冰,等.棉燈籠果實(shí)總黃酮提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011(21)：33-35.

(2016-09-13收稿，2016-11-26修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

Technology Optimization for Extracting Total Flavonoids from the Root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant．

MENG Xin, LIU Yao, CHEN Rui, CAI Jin, MAO Zhengyi, LIU Jiani, LIU Lina, HUANG Jing

(CollegeofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

Objective: To explore the extraction process of total flavonoids in the root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant. Methods: The solid-liquid ratio, ethanol concentration, extraction time, extraction temperature were selected as factors and the yield of total flavonoids as evaluation index. The extraction process was optimized by orthogonal test, and the content of total flavonoids in the root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant was determined by UV spectrophotometry. Results: The optimum parameters of extraction process of total flavonoids from the root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant was a follow: solid-liquid ratio 1∶10, ethanol volume fraction 60%, extraction time 2 h, extraction temperature 70 ℃. Under above condition, the content of total flavonoids from the root ofRubusmultibracteatusLevl & Vant was 4.8%. Conclusion: The method is practical, accurate and reliable, and can be used as quality control method ofRubusmultibracteatusLevl & Vant.

drug,Chinese herbal; plants extracts;RubusmultibracteatusLevl & Vant.; total flavonoids; orthogonal experiment

貴州省科技廳中藥攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合ZY(2011)3005]

時(shí)間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.001.html

R285.1

A

1000-2707(2016)12-1411-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.010

**貴州醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:huangjgy@sohu.com