王 杰， 喻 超， 周顯飛， 蔡 坤， 何志偉， 江建新

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

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miRNA-1181通過(guò)抑制STAT3影響人胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力*

王 杰， 喻 超， 周顯飛， 蔡 坤， 何志偉， 江建新**

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的： 探討miRNA-1181(miR-1181)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響以及機(jī)制。方法： 選取胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和MIA PaCa-2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并構(gòu)建miR-1181過(guò)表達(dá)慢病毒載體(miR-1181U)，低表達(dá)慢病毒載體(miR-1181D)以及空載慢病毒載體(NC)，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)感染效率；Transwell實(shí)驗(yàn)以及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，免疫熒光檢測(cè)miR-1181對(duì)細(xì)胞骨架的影響，Western bolt檢測(cè)STAT3的表達(dá)；構(gòu)建si-STAT3并轉(zhuǎn)染miR-1181低表達(dá)組(miR-1181D)，重復(fù)transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證STAT3是其靶基因。結(jié)果： qRT-PCR顯示3條不同序列的si-STAT3均能顯著下調(diào)STAT3的表達(dá)；Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)顯示上調(diào)miR-1181后能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移(P<0.05)，下調(diào)miR-1181后能顯著促進(jìn)胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移(P<0.05)；Western blot顯示miR-1181U能抑制STAT3的表達(dá)，miR-1181D能促進(jìn)STAT3的表達(dá)；免疫熒光顯示在PANC-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-1181后，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白(F-actin)被剪切，呈現(xiàn)低表達(dá)，導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)和極性的缺失，從而遷移能力變?nèi)?；si-STAT3以后能減弱miR-1181D組對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。結(jié)論： miR-1181可能通過(guò)抑制STAT3來(lái)抑制人胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，有望成為胰腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

胰腺腫瘤； miR-1181； 腫瘤侵襲； 腫瘤轉(zhuǎn)移； STAT3

胰腺癌是全球致死性排名第四的惡性腫瘤[1]，預(yù)計(jì)到2030年排名有望上升至第2位[2]。腫瘤細(xì)胞早期的惡性侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其治療效果差，預(yù)后不良的主要原因之一[3]。微小RNA(miRNAs)在人類多種疾病特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演了關(guān)鍵的角色，通過(guò)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及凋亡等進(jìn)程[4]。本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)miR-1181在胰腺癌中呈低表達(dá)，并已成功構(gòu)建上調(diào)組慢病毒(miR-1181U)、陰性對(duì)照組慢病毒(NC)以及下調(diào)組慢病毒(miR-1181D)，證實(shí)miR-1181能通過(guò)調(diào)控STAT3影響胰腺癌干細(xì)胞的干性[5]，本文主要探究miR-1181對(duì)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和制劑

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1、MIA PaCa-2由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P公司負(fù)責(zé)包裝和構(gòu)建，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，STAT3(1∶500)抗體以及P-STAT3(1∶500)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，siSTAT3購(gòu)自上海生工，鬼筆環(huán)肽、β-tubulin以及DAPI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將前期研究已感染慢病毒的胰腺癌細(xì)胞PANC-1和MIA PaCa-2置于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞分為上調(diào)組(miR-1181U)、下調(diào)組(miR-1181D)、陰性對(duì)照組(NC)以及空白對(duì)照組(BC)。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 分別制備PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞懸液，密度為2×105個(gè)/mL，并分別接種于六孔板中，待其融合度達(dá)到50%，分別將3條序列不同的si-STAT3和si-NC與lipofectamine 3 000混合孵育20 min后加入每孔中，24 h后細(xì)胞換液，96 h后采用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，選取轉(zhuǎn)染效果最好的一條si-STAT3用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 分別制備PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞懸液(用不含血清(FBS)的培養(yǎng)基重懸)，密度為1×105個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液于transwell小室的上室面，下室面放入含10% FBS的600 μL培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用棉簽擦去上室面細(xì)胞，晾干，拍照。

1.2.4 Matrigel 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用無(wú)血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按1∶8稀釋，每孔加入60 μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置4 h，待膠凝固后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟同上述遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 用0.25%胰蛋白酶分別消化PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞，于六孔板中每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，待孔內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，用200 μL槍頭垂直劃幾條直線，并在0、24 h分別在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6 細(xì)胞骨架免疫熒光 制備PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞爬片，密度為1×105個(gè)/mL，待其貼壁后4%多聚甲醛固定。觀察當(dāng)天取出PBS洗滌2遍，再用0.1%Triton X-100的PBS洗滌3～5 min，于1%BSA中封閉1 h。分別制備1∶50以及1∶100的熒光素鬼筆環(huán)肽及β-tubulin置于玻片上染色2 h，PBS再次洗滌2次，DAPI染色10 min，最后PBS洗滌后封片劑封片，于共聚焦激光顯微鏡下觀察。

1.2.7 GAPDH、STAT3及p-STATS表達(dá) 收集細(xì)胞提取蛋白，采用BCA法測(cè)蛋白濃度后按50 ng上樣量計(jì)算出上樣體積，SDS-凝膠電泳，孵育GAPDH(1∶1 000)、STAT3(1∶500)、p-STAT3(1∶500)一抗4度搖床過(guò)夜，室溫孵育二抗2 h后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光，Western bolt檢測(cè)GAPDH、STAT3及p-STAT3的蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率

分別轉(zhuǎn)染3條不同序列si-STAT3于PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞后，STAT3的基因表達(dá)量明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖1。

(1)P<0.05圖1 轉(zhuǎn)染siSTAT3后STAT3的表達(dá)Fig.1 The expression of STAT3 after transfected siSTAT3

2.2 miR-1181抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移

Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示,PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞的miR-1181U組侵襲轉(zhuǎn)移能力均明顯受到抑制，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯少于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。相反，PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞的miR-1181D組侵襲轉(zhuǎn)移能力均明顯增強(qiáng)，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯多于NC組，而miR-1181D+si-STAT3組則侵襲轉(zhuǎn)移能力變?nèi)?，?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯少于miR-1181D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-1181U組細(xì)胞遷移的距離明顯短于NC及BC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

2.3 miR-1181對(duì)細(xì)胞骨架的影響

在PANC-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-1181后，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白(F-actin)被剪切，呈現(xiàn)低表達(dá)，導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)和極性的缺失，從而遷移能力變?nèi)酢C組和NC組中，F(xiàn)-actin不被剪切，大量聚集形成偽足和極性，為間充質(zhì)移動(dòng)方式向阿米巴樣移動(dòng)方式的轉(zhuǎn)變過(guò)程提供所必須的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)和極性，故遷移能力強(qiáng)(圖5)。

2.4 STAT3及P-STAT3的蛋白表達(dá)

Western bolt結(jié)果顯示，上調(diào)miR-1181后能抑制STAT3以及磷酸化STAT3的表達(dá)，而下調(diào)miR-1181后則促進(jìn)STAT3以及磷酸化STAT3的表達(dá)(圖6)。

3 討論

MicroRNA(miRNA)是一組由19～22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA，它能通過(guò)與靶mRNA的3’UTR特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[6]。大量研究表明，這些單鏈RNA在細(xì)胞的正常生命周期中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7-9]。Zhang B等[10]研究表明miR-489在胃癌之中扮演了抑癌基因的角色，通過(guò)直接作用于PROX1蛋白抑制胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移能力。Wang C等[11]研究發(fā)現(xiàn)MiR-323-3p能在胰腺癌中抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移，且通過(guò)直接抑制靶蛋白SMAD2以及SMAD3實(shí)現(xiàn)抑制胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。STAT3(信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3)在一系列細(xì)胞過(guò)程中扮演了重要的角色，如細(xì)胞增殖、凋亡以及免疫抑制等[12]。JAK-STAT信號(hào)通路最初是發(fā)現(xiàn)于干擾素α，干擾素γ以及白介素6共同參與調(diào)控的下游信號(hào)通路[12]。STAT3在信號(hào)傳導(dǎo)及

注：A為PANC-1，B為MIA PaCa-2；(1)P<0.05圖2 miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響(transwell)Fig.2 Transwell assay detected the effect of miR-1181 on migration and invasion of pancreatic cancer

注：A、B為PANC-1，C、D為MIA PaCa-2；(1)P<0.05圖4 miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響(劃痕實(shí)驗(yàn))Fig.4 Wound healing assay detected the effect of miR-1181 on invasion of pancreatic cancer

圖5 免疫熒光檢測(cè)miR-1181對(duì)細(xì)胞骨架的影響(600×)Fig.5 Immunofluorescence detected the influence of miR-1181 on cytoskeleton

圖6 miR-1181對(duì)STAT3及p-STAT3表達(dá)的影響(Western bolt)Fig.6 Western bolt detected the effect of miR-1181 on STAT3 and p-STAT3

轉(zhuǎn)錄激活上發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[13]。目前已發(fā)現(xiàn)STAT家族有6個(gè)成員，STAT3是家族中最普遍存在的，當(dāng)接受細(xì)胞因子或者生長(zhǎng)因子刺激后，STAT3作用于細(xì)胞核內(nèi)以二聚體的形式特異性結(jié)合DNA片段，調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄。如果通路持續(xù)激活，將導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖以及周邊侵襲[13]。STAT3能通過(guò)各種靶基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括細(xì)胞周期調(diào)控因子，血管生成因子以及抗凋亡基因等[14]。

本研究通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了miR-1181能抑制胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。并通過(guò)western bolt觀察了miR-1181對(duì)靶蛋白STAT3的影響，即過(guò)表達(dá)miR-1181能抑制STAT3的表達(dá)，低表達(dá)miR-1181能促進(jìn)STAT3的表達(dá)。進(jìn)一步我們?nèi)藶楦蓴_了STAT3的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)miR-1181D組的促進(jìn)作用被抑制。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PANC-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-1181后，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白(F-actin)被剪切，呈現(xiàn)低表達(dá)，導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)和極性的缺失，從而遷移能力變?nèi)?。miR-1181U組F-肌動(dòng)蛋白和β-微管蛋白較NC及BC組明顯減少，BC組和NC組中，F(xiàn)-actin不被剪切，大量聚集形成偽足和極性，為間充質(zhì)移動(dòng)方式向阿米巴樣移動(dòng)方式的轉(zhuǎn)變過(guò)程提供所必須的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)和極性，故遷移能力強(qiáng)。綜上我們可以得出結(jié)論，miR-1181能通過(guò)抑制STAT3的表達(dá)來(lái)影響胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

總之，miR-1181在胰腺癌中作為一種抑癌基因，能抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，有望成為治療胰腺癌的新靶點(diǎn)。

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(2016-09-16收稿，2016-11-13修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 蘇曉慶

Capacity of miRNA to Influence the Migration and Invasion of Pancreatic Cancer through Inhibiting STAT3

WANG Jie, YU Chao, ZHOU Xianfei, CAI Kun, HE Zhiwei, JIANG Jianxin

(DepartmentofHepatic-Biliary-PancreaticSurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,GuizhouChina)

Objective: To investigate the effect of microRNA-1181 on the migration and invasion of pancreatic cancer and its potential mechanism. Methods: Lentiviral vectors of miR-1181 including overexpression (miR-1181U), knockdown (miR-1181D) and a negative control (NC) were constructed, and were transfected into human pancreatic cancer cell lines PANC-1 and MIA-PaCa-2 respectively. The expressions of miR-1181 were detected by real-time PCR. Transwell assay and wound healing assay were employed to detect cell invasion ability. The influence of miR-1181 on cytoskeleton was detected with immunofluorescence technique, and the expression of STAT3 detected by Western bolt. siRNA for STAT3 was constructed and transfected into miR-1181D, and then transwell assay was repeated to ensure that STAT3 was the miR-1181's target. Results: qRT-PCR results showed that 3 different si-STAT3 decreased expression of STAT3. Transwell assay and wound healing assay showed that miR-1181U inhibited cell migration and invasion (P<0.05), and miR-1181D promoted cell migration and invasion (P<0.05) significantly. Furthermore, miR-1181U inhibited the expression of STAT3 while miR-1181D up-regulated the expression of STAT3. Immunofluorescence test showed that when miR-1181 overexpressed in PANC-1 cells, F-actin was cut, and its expression was low. As the results, cells lost movement structure and polarity, and their migration capability was weakened. si-STAT3 can decrease the promotion effect of miR-1181 on migration and invasion in pancreatic cancer. Conclusion: miR-1181 may inhibit cell migration and invasion of pancreatic cancer by suppressing STAT3, which suggests it might be a potential new therapeutic agent for pancreatic cancer.

pancreatic neoplasms; miR-1181; tumor migration; tumor invasion; STAT3

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)資助(2014DFA31420); 國(guó)家自然科學(xué)基金(81160311，81572429，81660483)

時(shí)間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.014.html

R735.9

A

1000-2707(2016)12-1387-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.005

**通信作者 E-mail:jjx731003@163.com