王 杰， 喻 超， 周顯飛， 朱昌豪， 黃 巍， 江建新

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

?

·專題研究2·

miRNA-1181抑制人胰腺癌細(xì)胞的增殖*

王 杰， 喻 超， 周顯飛， 朱昌豪， 黃 巍， 江建新**

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的： 探討miRNA-1181(miR-1181)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。方法： 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-RCR)檢測(cè)miR-1181在4株人胰腺癌細(xì)胞系及1株人正常胰腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá)，選取miR-1181表達(dá)差異較明顯的PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；構(gòu)建miR-1181過(guò)表達(dá)慢病毒載體(miR-1181U)以及空載慢病毒載體(NC)，采用qRT-PCR檢測(cè)感染效率；在體外采用CCK-8實(shí)驗(yàn)，平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響；建立裸鼠皮下成瘤模型，用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞成瘤能力的影響。結(jié)果： qRT-PCR顯示4株胰腺癌細(xì)胞系中miR-1181表達(dá)量低于正常胰腺上皮細(xì)胞(P<0.05)；過(guò)表達(dá)miR-1181后PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制(P<0.05)，細(xì)胞集落形成數(shù)量明顯減少(P<0.05)；裸鼠皮下成瘤模型顯示過(guò)表達(dá)miR-1181后腫瘤體積及免疫組化指標(biāo)Ki67均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論： 過(guò)表達(dá)的miR-1181能在體內(nèi)體外抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，有望成為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。

胰腺腫瘤； 細(xì)胞； 增殖； 慢病毒感染； 微小RNA； miR-1181

胰腺癌因其早期不易診斷，治療效果差，預(yù)后不理想，被譽(yù)為致死性最高的消化道惡性腫瘤之一[1]，因此早期精確的診斷以及新型的治療手段對(duì)胰腺癌的診治尤其重要[2]。miRNA是一類非編碼的微小RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后或者翻譯水平與靶mRNA結(jié)合，使其降解并抑制基因的表達(dá)從而參與調(diào)控細(xì)胞的一系列生物行為[3]。本課題組前期研究表明miR-1181能抑制腫瘤干細(xì)胞成球形成率以及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133的表達(dá)，并且能減少側(cè)群細(xì)胞的形成[4]；還有研究表明miR-1181可通過(guò)直接抑制SOX2和STAT3來(lái)抑制腫瘤干細(xì)胞的干擾[4]，本研究主要探討miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及試劑 人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2以及人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P公司負(fù)責(zé)包裝和構(gòu)建，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，Ki67抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.1.2 動(dòng)物 免疫缺陷小鼠(Balb/c nude mice)購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，雌性，4周齡，體質(zhì)量14～15 g。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE、人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1、BxPC-3用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，人胰腺癌細(xì)胞PANC-1和MIA PaCa-2用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 miR-1181在人胰腺癌及正常胰腺細(xì)胞中的表達(dá) 根據(jù)Trizol說(shuō)明書(shū)提取各類細(xì)胞中總RNA，選取吸光度為1.8～2.0(A260/A280)的樣本用于實(shí)驗(yàn)。再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，以U6作為內(nèi)參，分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為70 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。以U6作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)為25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法(relative quantitative，RQ)表示miR-1181的表達(dá)量。

1.2.3 慢病毒感染及效率檢測(cè) 根據(jù)PCR結(jié)果選取兩株胰腺癌細(xì)胞系，待其貼壁生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，用0.05%胰酶消化傳代培養(yǎng),按慢病毒感染手冊(cè)感染胰腺癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為過(guò)表達(dá)組(miR-1181U)，陰性對(duì)照組(NC)和空白對(duì)照組(BC)3組，待其感染1周后采用RT-PCR檢測(cè)感染效率。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個(gè)/L，接種到96孔板中，每孔約100 μL細(xì)胞懸液，每個(gè)樣約5個(gè)副孔。分別于4、24、48、72、96 h加入含10% CCK8的培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 h后測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm時(shí)每孔的吸光度。

1.2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)/L，于六孔板中種植2 000個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～8 d后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，計(jì)數(shù)每孔克隆形成數(shù)量并拍照記錄。

1.2.6 裸鼠皮下成瘤模型 將6只裸鼠隨機(jī)分成陰性對(duì)照組(NC組)和過(guò)表達(dá)組(miR-1181U組)，分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，用PBS重懸后棄上清，再將PBS與Matrigel基質(zhì)膠按1∶1體積混合，將混合液重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010個(gè)/L，于每只裸鼠的右后腿部皮下注射200 μL細(xì)胞懸液。在相同條件下(間斷12 h光照與黑暗，自由進(jìn)食等)飼養(yǎng)6周，每周觀察1次裸鼠，記錄裸鼠體質(zhì)量及腫瘤大小。6周后采用頸部脫臼法處死裸鼠，解剖裸鼠取出腫瘤并拍照。

1.2.7 Ki67在裸鼠腫瘤中的表達(dá) 將解剖后的裸鼠腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色；將細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67按1∶400稀釋后染色。每組腫瘤切片隨機(jī)選取5張切片，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-1181的表達(dá)

與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE相比，4株胰腺癌細(xì)胞miR-1181均為低表達(dá)，其中AsPC-1、PANC-1、MIA PaCa-2細(xì)胞株中miR-1181，顯著低于HPDE細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BxPC-3細(xì)胞株中miR-1181表達(dá)量與HPDE比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1A。

2.2 miR-1181慢病毒在胰腺癌中的感染效率

根據(jù)細(xì)胞系表達(dá)情況，選取PANC-1和MIA PaCa-2作為實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系，并感染慢病毒。PANC-1、MIA PaCa-2兩株細(xì)胞miR-1181U組均比BC組和NC組顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1B,1C。

注：A為miR-1181在胰腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)，B為PANC-1感染慢病毒后各組miR-1181的表達(dá)， C為MIA PaCa-2感染慢病毒后各組miR-1181的表達(dá)；(1)P<0.05，(2)P < 0.01圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-1181表達(dá)Fig.1 MiR-1181 expression evaluated by PCR

2.3 miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

當(dāng)PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)72 h及96 h時(shí)，miR-1181U組吸光度值較NC組和BC組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)；當(dāng)MIA PaCa-2細(xì)胞培養(yǎng)96 h時(shí)，miR-1181組吸光度值較NC組和BC組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

注：A為PANC-1細(xì)胞系，B為MIA PaCa-2細(xì)胞系；(1)P<0.05圖2 miR-1181U對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響(CCK-8)Fig.2 The effect of miR-1181U on proliferation of pancreatic cancer cells

2.4 miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞集落形成的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-1181U組集落形成數(shù)量PANC-1為(334.7±16.48)，MIA PaCa-2為 (153.7±8.51)；NC組集落形成數(shù)量PANC-1為(917.0±37.58)，MIA PaCa-2為(308.0±11.15)；BC組集落形成數(shù)量PANC-1為(910.7±36.99)，MIA PaCa-2為(316.7±13.16)；miR-1181U組較NC組及BC組集落形成數(shù)量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

注：(1)P<0.05圖3 miR-1181U對(duì)胰腺癌細(xì)胞克隆形成的影響(平板克隆)Fig.3 The effect of miR-1181U on colony forming of pancreative cancer cells

2.5 miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響

裸鼠每組3只，注射細(xì)胞懸液后飼養(yǎng)6周，取出腫瘤，測(cè)定腫瘤體積volume(mm3)，miR-1181U組(155.3±9.03)mm3，NC組(291.0±11.37)mm3，miR-1181U組較NC組腫瘤體積明顯變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.6 miR-1181對(duì)腫瘤增殖膜指標(biāo)Ki67的影響

免疫組化結(jié)果顯示，Ki67的相對(duì)表達(dá)量miR-1181U組為(0.18±0.02)，NC組為(0.55±0.03)，miR-1181U組Ki67表達(dá)量明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

(1)P<0.05圖4 miR-1181裸鼠皮下成瘤能力Fig.4 Subcutaneous tumor formation in nude mice to detect subcutaneous tumor forming ability of miR-1181

(1)P<0.05圖5 miR-1181對(duì)增殖指標(biāo)Ki67的影響(免疫組化，×400)Fig.5 The effect of miR-1181on Ki67 expression

3 討論

近期研究顯示，約30%的蛋白編碼基因受miRNA所調(diào)控，每條miRNA都能特異性結(jié)合靶基因mRNA的3′-UTR序列，從而參與調(diào)控成千上萬(wàn)的基因表達(dá)[5]。miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，參與機(jī)體的各種生理功能，如胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡等。miRNA的異常表達(dá)在疾病發(fā)生、發(fā)展包括腫瘤形成過(guò)程中起到了顯著的作用[6]。有研究表明，miRNA-330-5p在結(jié)腸癌中表達(dá)量明顯低于癌旁組織，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-330-5p后能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力，并通過(guò)“雙熒光素酶報(bào)告分析”確定人整合素5(ITGA5)是其直接作用靶基因[7]。Pei YF等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a不僅能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，還能促進(jìn)乳腺癌上皮細(xì)胞向間(充)質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)而獲得遷徙能力。而在胰腺癌的報(bào)道中，Tanaka R等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-17-92能通過(guò)MEK-ERK信號(hào)通路影響胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2的細(xì)胞周期，阻滯細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期，進(jìn)而影響增殖能力。Chang W等[10]通過(guò)癌癥基因組圖譜中發(fā)現(xiàn)miR-377在胰腺癌中呈低表達(dá)，并實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-377在組織及細(xì)胞中均呈低表達(dá)，進(jìn)一步確定Pim-3為其直接作用靶點(diǎn)，miR-377通過(guò)抑制Pim-3的表達(dá)來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。迄今為止，對(duì)miR-1181的研究甚少，只在卵巢癌和肝癌報(bào)道中有所提及[11-12]。本課題組前期研究只表明miR-1181能影響胰腺癌細(xì)胞干性[4]，并未直接闡明miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響。另一方面，miR-1181的直接作用靶蛋白尚未明確，是否通過(guò)影響某些通路(如MAPK通路，PI3K/AKT通路和Hedgehog通路)進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖，均需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究[13-15]。

本研究重點(diǎn)從體內(nèi)體外兩方面說(shuō)明miR-1181對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖有明顯影響。體外采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)分別表明miR-1181能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖以及減少克隆集落的形成。體內(nèi)建立裸鼠皮下成瘤模型證實(shí)miR-1181能抑制胰腺癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤，且腫瘤免疫組化切片顯示miR-1181能抑制Ki67的表達(dá)。故我們可以得出結(jié)論，miR-1181能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。

綜上，miR-1181在胰腺癌中是作為一種抑癌基因的形式而存在的，能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞體外增殖以及體內(nèi)成瘤，為進(jìn)一步研究其具體機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，miR-1181有望成為胰腺癌診治的潛在靶點(diǎn)。

[1] Hidalgo M. Pancreatic cancer[J]. N Engl J Med， 2010(17): 1605-1617.

[2] Szafranska AE, Davison TS, John J, et al. MicroRNA expression alterations are linked to tumorigenesis and non-neoplastic processes in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Oncogene, 2007(30): 4442-4452.

[3] Jiang B, Mu W, Wang J, et al. MicroRNA-138 functions as a tumor suppressor in osteosarcoma by targeting differentiated embryonic chondrocyte gene[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016 (1): 69.

[4] Jiang J, Li Z, Yu C, et al. MiR-1181 inhibits stem cell-like phenotypes and suppresses SOX2 and STAT3 in human pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2015(2): 962-970.

[5] Schultz NA, Dehlendorff C, Jensen BV, et al. MicroRNA biomarkers in whole blood for detection of pancreatic cancer[J]. JAMA, 2014(4): 392-404.

[6] Ambros V. The functions of animal microRNAs[J]. Nature, 2004(7006): 350-355.

[7] Yoo HI, Kim BK, Yoon SK. MicroRNA-330-5p negatively regulates ITGA5 expression in human colorectal cancer[J]. Oncol Rep, 2016 (2):280.

[8] Pei YF, Lei Y, Liu XQ. MiR-29a promotes cell proliferation and EMT in breast cancer by targeting ten eleven translocation [J]. Biochim Biophys Acta, 2016(11): 2177-2185.

[9] Tanaka R, Tomosugi M, Sakai T, et al. MEK inhibitor suppresses expression of the miR-17-92 cluster with G1-phase arrest in HT-29 human colon cancer cells and MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells[J]. Anticancer Res, 2016(9): 4537-4543.

[10]Chang W, Liu M, Xu J, et al. MiR-377 inhibits the proliferation of pancreatic cancer by targeting Pim-3[J]. Tumour Biol, 2016 (5):537-539.

[11]Zhang HY, Li JH, Li G. Activation of ARK5/miR-1181/HOXA10 axis promotes epithelial-mesenchymal transition in ovarian cancer[J]. Oncol Rep, 2015(3): 1193-1202.

[12]Liu X, Wang T, Wakita T, et al. Systematic identification of microRNA and messenger RNA profiles in hepatitis C virus-infected human hepatoma cells[J]. Virology, 2010(1): 57-67.

[13]Ji S, Qin Y, Shi S, et al. ERK kinase phosphorylates and destabilizes the tumor suppressor FBW7 in pancreatic cancer[J]. Cell Res, 2015(5): 561-573.

[14]Mao Y, Xi L, Li Q, et al. Regulation of cell apoptosis and proliferation in pancreatic cancer through PI3K/Akt pathway via Polo-like kinase [J]. Oncol Rep, 2016 (1): 49-56.

[15]Bai Y, Bai Y, Dong J, et al. Hedgehog signaling in pancreatic fibrosis and cancer[J]. Medicine (Baltimore), 2016(10): 2996.

(2016-10-06收稿，2016-11-28修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

The Inhibiting Effect of miRNA-1181 on Cell Proliferation of Pancreatic Cancer Cell

WANG Jie, YU Chao, ZHOU Xianfei, ZHU Changhao, HUANG Wei, JIANG Jianxin

(DepartmentofHepatic-Biliary-PancreaticSurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of microRNA-1181 on the proliferation of pancreatic cancer. Methods: Quantitative polymerase chain reaction (qRT-RCR) was adopted to detect the expression of miR-1181 in 4 human pancreatic cancer cell lines and 1 human normal pancreatic epithelial cell lines. The PANC-1 and MIA PaCa-2 cell lines with significantly different miR-1181 expression were selected for subsequent experiments. The miR-1181 over-expression lentiviral vector (miR-1181U) and the empty lentiviral vector vector (NC) were constructed and qRT-PCR was used to detect infection efficiency. The effect of miR-1181 on the proliferation of pancreatic cancer cells was detected by CCK-8 assay and Plate cloning experiment in vitro. The subcutaneous tumor model of nude mice was established, and the effect of miR-1181 on the ability of pancreatic cancer cells was detected by immunohistochemistry. Results: qRT-PCR showed that the expression of miR-1181 in 4 pancreatic cancer cell lines was significantly lower than that in normal pancreatic epithelial cells (P<0.05). The proliferation ability of PANC-1 and MIA PaCa-2 cells was significantly inhibited after over-expression of miR-1181 (P<0.05), and the number of colony formation was significantly decreased (P<0.05). Subcutaneous tumor model in nude mice showed that the tumor size and immunohistochemistry index Ki67 were significantly lower than those in the normal control group (P<0.05) after over-expression of miR-1181. Conclusion: Over-expression of miR-1181 can inhibit the proliferation of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo, and is expected to become a new target for the treatment of pancreatic cancer.

pancreatic neoplasms; cells; proliferation; lentivirus infections; micro RNA; miR-1181

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)資助(2014DFA31420); 國(guó)家自然科學(xué)基金(81160311，81572429，81660483)

時(shí)間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.005.html

R735.9

A

1000-2707(2016)12-1382-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.004

**通信作者 E-mail:jjx731003@163.com