董陽婷， 譚龍春， 官志忠,**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 病理科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

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β-淀粉樣肽對大鼠原代海馬神經(jīng)細胞中SIRTs表達的影響*

董陽婷1， 譚龍春2， 官志忠1,2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 病理科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討β-淀粉樣蛋白(Aβ)對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子( SIRTs)表達的影響。方法： 分離出生24 h內(nèi)SD乳鼠大腦海馬區(qū)域，培養(yǎng)原代神經(jīng)細胞，CCK-8試驗觀察0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5及2.0 μmol/L Aβ寡聚體(AβOs)對細胞增殖的影響，選取恰當(dāng)濃度的AβOs進行后續(xù)實驗；將實驗分為對照組(Control)和Aβ組，Aβ組給AβOs 處理24 h后，運用Western blotting方法及Realtime PCR方法檢測SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5的蛋白及mRNA表達水平。結(jié)果： CCK-8結(jié)果顯示，0.5 μmol/L AβOs作用于大鼠原代海馬神經(jīng)細胞24 h時細胞存活率明顯低于對照組(P<0.05)，且不影響細胞的存活率；0.5 μmol/L AβOs處理大鼠原代海馬神經(jīng)細胞24 h后，與Control相比，SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5蛋白及mRNA表達水平均不同程度降低(P<0.05或0.01)。結(jié)論： AβOs可使海馬神經(jīng)細胞中SIRTs 蛋白及mRNA表達水平降低，這可能與AD病人發(fā)病后學(xué)習(xí)記憶能力減退有關(guān)。

阿爾茨海默??； β-淀粉樣肽1-42； 海馬神經(jīng)元； 沉默信息調(diào)節(jié)因子

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)，又稱原發(fā)性老年癡呆癥，是一種主要在老年期發(fā)生的神經(jīng)元退行性變性疾病，以進行性癡呆為主要特征，包括記憶力衰退、認知功能障礙、失語、性格和行為改變等，該病首先由德國的精神病醫(yī)生Alois Alzheimer[1-2]于1907年發(fā)現(xiàn)，并以他的名字命名。AD的主要病理改變是相關(guān)腦區(qū)出現(xiàn)以β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques，SPs)、高度磷酸化Tau蛋白聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NITs)及神經(jīng)元丟失[3]，研究還發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)病機制與β-淀粉樣肽沉積、脂質(zhì)代謝、線粒體老化、氧化應(yīng)激、凋亡及突觸功能有著密切關(guān)系[4-6]。沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulators, SIRTs)是具有去乙酰化作用的蛋白，其激活依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)，研究表明哺乳動物SIRTs可與p53、FOXO、PGC-1α、NF-κB、Ku70等蛋白相互作用調(diào)控細胞應(yīng)激反應(yīng)、代謝衰老和凋亡等過程，尤其是在神經(jīng)退行性疾病中扮演了重要角色。本研究用AβOs處理原代海馬神經(jīng)元細胞，建立類AD細胞模型，觀察AβOs對神經(jīng)元中SIRTs的作用，探討AD發(fā)病中學(xué)習(xí)記憶能力減退的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

實驗動物為24 h內(nèi)新生SD (Sprague Dawley)乳鼠14只，體重5～10 g(由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(編號1311018)。主要試劑有多聚賴氨酸、Aβ1-42、六氟異丙醇購自Sigma公司(美國),Neurobasal-A 培養(yǎng)基、Hibernate-A培養(yǎng)基、B-27添加劑、GlutaMAX添加劑購自Gibco公司(美國),青霉素及鏈霉素購自Hyclone公司(美國),BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司(美國), CCK-8試劑盒購自Dojindo公司(日本),鼠抗SIRT1抗體購自Abcam公司(英國),兔抗SIRT3抗體購自Santa Cruz公司(美國),兔抗SIRT4抗體購自Gene Tex公司(美國),鼠抗SIRT5抗體購自Santa Cruz公司(美國)；兔抗β-actin(Abmart,上海),辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔、抗鼠二抗均購自Cell Signaling公司(美國),Trizol 試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 Fermentas Life Sciences公司),SYBR Green染料試劑盒(美國 Roche Diagnostics公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外制備AβOs 參照文獻[7-10]在體外制備AβOs的方法，將Aβ1-42粉末中加入充分預(yù)冷的HFIP，使其終濃度為1 mmol/L。瓶口保持封閉，室溫孵育60 min后，冰上靜置10 min，分裝成5管，開蓋通風(fēng)過夜，使HFIP完全揮發(fā)后，-80 ℃冰箱保存。使用時于冰上加入DMSO充分溶解，終濃度為5 mmol/L，再用不含酚紅的F12培養(yǎng)基稀釋，4℃孵育24 h后，14 000 g，4 ℃離心10 min，備用。

1.2.2 大鼠原代海馬神經(jīng)細胞的培養(yǎng) 大鼠原代海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)參考文獻[7]并適當(dāng)改進。取新生SD乳鼠，75%酒精浸泡5 min，無菌條件下取出大腦，放入預(yù)冷的D-Hank’s平衡鹽液中，迅速去除腦膜及血管。海馬以0.25% 胰蛋白酶37 ℃消化15 min，中間振搖3次，用含10%胎牛血清的DMEM-F12種植培養(yǎng)基終止消化，吸出種植培養(yǎng)基，加入含2% B27的Neurobasal培養(yǎng)基，輕輕吹打20次，靜置2 min，輕輕吸取上層細胞懸液，用含2% B27的Neurobasal培養(yǎng)基稀釋成單細胞懸液,以1×109個/L密度接種在經(jīng)左旋賴氨酸(PLL)鋪被過的6孔板內(nèi)，于37 ℃，相對體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔3 d以Neurobasal-A/B27培養(yǎng)基半量換液。

1.2.3 細胞毒性實驗 采用CCK-8法，原代海馬神經(jīng)細胞以1×108個/L濃度接種于96孔板中，分別以0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5及2.0 μmol/L的AβOs處理細胞，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，每孔加100 μL細胞懸液，培養(yǎng)至24 h后，將每孔原始培養(yǎng)基取出，置換為不含B27及藥物的純培養(yǎng)基100 μL，空白對照組加入100 μL無細胞純培養(yǎng)基，于每孔中加入10μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，450 nm波長測定吸光度。

1.2.4 AβOs處理細胞 大鼠原代海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)至第7～10 天，形態(tài)完整時，用不含B27的純培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，加入0.5 μmol/L AβOs處理24 h后收集細胞，強效裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。

1.2.5 SIRT1、SIRT3～5蛋白表達水平 用5×蛋白上樣緩沖液及去離子水按照樣品濃度稀釋樣品，95 ℃加熱變性5 min，然后進行電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用SIRT1及SIRT 3～5抗體(濃度分別為1∶1 000、1∶500、1∶1 000及1∶300)與轉(zhuǎn)蛋白膜4 ℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶聯(lián)結(jié)的抗兔或抗鼠IgG(濃度為1∶5 000)室溫孵育1 h。將膜與ECL-plus試劑反應(yīng)，顯影膠片曝光，沖洗膠片后用圖像分析儀處理。

1.2.6 SIRT、SIRT 3～5 mRNA表達水平 采用標準Trizol-酚-氯仿一步法提取總RNA，設(shè)計SIRT1及SIRT 3～5和β-actin引物，引物序列見表1。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行Real-time PCR。SDS 1.4軟件分析其ΔCt、2-ΔCt值及RQ(relative quantity)值，RQ=2-ΔΔCt。分析實驗結(jié)果以β-actin為內(nèi)對照，計算各種基因的相對表達水平。

表1 SIRTs及β-actin基因引物序列Tab.1 Primer sequences of SIRTs gene and β-actin

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AβOs細胞毒性試驗

CCK-8試驗結(jié)果顯示，0.5 μmol/L AβOs作用于大鼠原代海馬神經(jīng)細胞24 h時細胞存活率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且不影響細胞的存活率，故選擇0.5 μmol/L Aβ1-42處理細胞進行以下研究。見圖1。

(1)與Control組比較，P<0.01圖1 不同濃度AβOs對大鼠原代海馬神經(jīng) 細胞存活率的影響Fig.1 The effect of different concentrations of AβOs on survival rate of primary rat hippocampal neurons

2.2 SIRT1及SIRT 3～5蛋白表達水平

與Control組相比，0.5 μmol/L AβOs處理大鼠原代海馬神經(jīng)細胞24 h后，SIRT1及SIRT3-5蛋白相對表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 SIRT1及SIRT 3～5 mRNA表達水平

與Control組相比，0.5 μmol/L AβOs處理大鼠原代海馬神經(jīng)細胞24 h后，SIRT1及SIRT3～5mRNA相對表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

3 討論

SIRTs是一組激活依賴于NAD+的具有去乙酰化作用的蛋白；研究表明，哺乳動物SIRTs可與p53、FOXO、PGC-1α、NF-κB、Ku70等蛋白相互作用調(diào)控著細胞應(yīng)激反應(yīng)、代謝衰老和凋亡等過程，尤其是在神經(jīng)退行性疾病，如AD中扮演了重要角色。目前人類SIRTs家族中公認的成員有7個，分別是SIRT1～SIRT7。目前研究最多的是SIRT1，其參與眾多神經(jīng)損傷及神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)保護作用[12-13]，尤其是在AD中具有復(fù)雜、多方面的神經(jīng)保護作用[14-16]，其與記憶的形成和維持與突觸可塑性、DNA甲基化、組蛋白尾的翻譯后修飾、非編碼RNA等機制有關(guān)，以小鼠作為模型，特異性敲除腦內(nèi)SIRT1的小鼠出現(xiàn)認知及記憶障礙，表明SIRT1在維持神經(jīng)可塑性方面發(fā)揮重要作用；突觸核蛋白(synuclein)是一種突觸前膜蛋白，其α亞型已被證實與帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，而且使用白藜蘆醇處理后可以對抗α-Synuclein的毒性[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，Tg2576小鼠大腦的初級神

注：(1)與Control組比較， P<0.01圖2 大鼠原代海馬神經(jīng)細胞中SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5蛋白表達水平Fig.2 The protein expression of SIRT1, SIRT3, SIRT4 and SIRT5 in primary rat hippocampal neurons after treated with AβOs

注：與Control組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01圖3 大鼠原代海馬神經(jīng)細胞中SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5 mRNA表達水平Fig.3 The mRNA expression of SIRT1, SIRT3, SIRT4 and SIRT5 in primary rat hippocampal neurons after treated with AβOs

經(jīng)元中過表達SIRT1基因，可減少Aβ的分泌，引起sAPPα水平升高，減少Rho激酶1(rho-activated kinase 1，ROCK1)的表達[16]，而通過抑制他汀類藥物刺激sAPPα生成激活ROCK1，可以減少SIRT1介導(dǎo)的一些反應(yīng)[19]。

另外，AD認知功能下降與年齡相關(guān)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能改變有關(guān)，如突觸功能障礙[20]，而突觸活動又強烈依賴于線粒體提供足夠ATP的功能[21]。SIRT 3～5存在于線粒體基質(zhì)中，可調(diào)節(jié)其多種代謝酶的乙?；饔茫谫嚢彼嵋阴；牡鞍踪|(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，超過20%的線粒體蛋白被乙?；@項研究證明SIRTs(主要是SIRT1及SIRT3) 去乙?；饔迷诰S持線粒體功能中起到重要的調(diào)節(jié)作用[22]。最近一項研究得出結(jié)論，AD患者大腦SIRT3表達降低，SIRT3在很大程度上通過抗氧化系統(tǒng)的靶向調(diào)節(jié)減少ROS的產(chǎn)生[23-24]；下調(diào)SIRT3可能破壞線粒體的能量代謝及合成，最終促進AD的病理變化[25]。另外兩個存在于線粒體內(nèi)的成員，包括SIRT4及SIRT5，其在AD發(fā)病機制中的作用并不十分清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1及SIRT 3～5蛋白及mRNA的表達在加入AβOs的原代海馬神經(jīng)元中均出現(xiàn)不同程度的降低。已有研究表明，SIRT3表達的程度與SIRT1的表達是平行的，SIRT1表達的降低可以直接影響SIRT3的表達[26]；當(dāng)SIRT1表達減少同時引起SIRT3表達減少，進一步抑制電子傳遞鏈(electron transfer chain, ETC)蛋白的線粒體復(fù)合物I活化，從而減少NAD+的生成，ROS產(chǎn)生增加，并抑制ATP生成，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡；另外，SIRT4表達減少可引起谷氨酸產(chǎn)生增多，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[27-28]；而沒有足夠的SIRT5發(fā)揮去乙酰化作用，引起細胞色素C在線粒體中的蓄積，進而導(dǎo)致線粒體膜間隙調(diào)節(jié)氧化代謝功能紊亂及細胞凋亡的發(fā)生[29]，最終促進AD的病理變化。

綜上所述，SIRTs家族對神經(jīng)系統(tǒng)具有一定保護作用，其可以通過不同途徑影響神經(jīng)退行性疾病的進展，現(xiàn)階段除了SIRT1及SIRT2研究較多以外，SIRT3-SIRT7在該類疾病中的作用尚不十分明確，弄清楚SIRTs家族在AD發(fā)病機制中所扮演的角色，對AD的防治起著關(guān)鍵性作用。

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(2016-10-15收稿，2016-12-03修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 周 凌

Effect of β-amyloid Peptide on SIRTs Expression in Rat Primary Hippocampal Neurons

DONG Yangting1, TAN Longchun2, GUAN Zhizhong1,2

(1.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.TheKeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseasesinMinistryofEducationofP.R.China,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of β-amyloid peptide (Aβ) on expressions of silent information regulators (SIRTs) in rat primary hippocampal neurons. Methods: Rat primary neurons were prepared and cultured from the brain hippocampus of newborn (within 24 h) SD rats. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) was employed to detect the effect of 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 μmol/L Aβ oligomers (AβOs) on proliferation of neurons．The appropriate concentration of AβOs was selected for subsequent experiments. Rat primary hippocampal neurons were divided into control group and Aβ group which was treated with Aβ for 24 h. The protein and mRNA expressions of SIRT1, SIRT3, SIRT4 and SIRT5 were detected by Western blotting and real-time PCR. Results: According to CCK-8 results, 0.5 μmol/L AβOs was selected for subsequent experiments. The protein and mRNA expression of SIRT1, SIRT3, SIRT4 and SIRT5 were significantly attenuated when the cells treated with 0.5 μmol/L AβOs for 24 h. Conclusions: AβOs can reduce the levels of protein and mRNA of SIRTs in rat primary hippocampal neurons, which might be a mechanism of cognitive deficit of AD．

Alzheimer's disease; β-amyloid peptide1-42; hippocampal neurons; silent information regulators

國家自然科學(xué)基金(81260173)； 教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助”(IRT13058)； 貴州省科技計劃[黔科合重大專項字(2014)6008號]； 貴州省創(chuàng)新計劃項目[黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心(2014)06]

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.027.html

R749.1； R34-33

A

1000-2707(2016)12-1376-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.003

**通信作者 E-mail:1457658298@qq.com