李琬悅，丁煜萌，王曦

神經(jīng)束路示蹤技術(shù)在脊髓損傷與再生研究中的應(yīng)用進展①

李琬悅1，丁煜萌1，王曦2

脊髓損傷是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域重要的研究方向之一，而神經(jīng)束路示蹤技術(shù)是其重要的研究手段。脊髓中神經(jīng)纖維性質(zhì)復(fù)雜，在人類和動物間存在很多分布差異。本文對神經(jīng)束路示蹤技術(shù)、脊髓損傷易累及的主要神經(jīng)纖維的分布特點和在種屬間的差異及神經(jīng)束路示蹤技術(shù)在脊髓損傷與再生研究中的應(yīng)用進行綜述。

脊髓損傷；神經(jīng)束路示蹤技術(shù)；逆行示蹤；順行示蹤；跨節(jié)示蹤；綜述

[本文著錄格式]李琬悅，丁煜萌，王曦.神經(jīng)束路示蹤技術(shù)在脊髓損傷與再生研究中的應(yīng)用進展[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2017,23(6):657-661.

CITED AS:Li WY,Ding YM,Wang X.Application of neural tract tracing techniques in study of spinal cord injury and regeneration (review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(6):657-661.

隨著現(xiàn)代交通和建筑業(yè)的發(fā)展，脊髓損傷發(fā)生率顯著增加。流行病學(xué)調(diào)查資料顯示[1-2]，全世界有250萬脊髓損傷患者。我國北京2002年脊髓損傷發(fā)生率為60/100萬，與20世紀(jì)80年代末調(diào)查得到的6.8/100萬的發(fā)病率相比顯著增加[3]。脊髓損傷后軸突難以再生，其高致殘率嚴(yán)重威脅人們的正常生活，是困擾廣大醫(yī)務(wù)人員和研究者的重大難題，因此成為重點關(guān)注的神經(jīng)科學(xué)研究方向之一。對該難題的研究，離不開神經(jīng)束路示蹤技術(shù)這一重要的研究手段。

不論何種性質(zhì)的神經(jīng)纖維，損傷的神經(jīng)纖維再生或從損傷區(qū)以外新生的軸突跨過損傷區(qū)與靶細(xì)胞重新建立功能聯(lián)系是恢復(fù)脊髓功能的唯一途徑。如果示蹤劑能夠通過軸漿運輸跨過損傷區(qū)，說明有再生或從損傷區(qū)以外新生的軸突跨過損傷區(qū)。由于大部分神經(jīng)纖維束路缺乏特異的免疫標(biāo)記，所以，神經(jīng)束路示蹤技術(shù)可以稱作研究軸突再生、判斷神經(jīng)元解剖結(jié)構(gòu)是否完整和功能關(guān)系是否建立的金標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。

脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維性質(zhì)復(fù)雜，脊髓損傷后，脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)都會受到不同程度的損傷。受損成分既會有運動性的，又會有感覺性的；既有大腦來源的，又有脊髓來源的；既有大腦皮層來源的，又有皮層下中樞來源的，這就使研究變得復(fù)雜。弄清脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維的分布特點，無疑對脊髓損傷的修復(fù)和再生研究具有重要意義。實驗動物是用來研究脊髓損傷的重要實驗對象，但是在它們的脊髓中，神經(jīng)纖維的分布和性質(zhì)與人類又有所不同，只有充分了解這些不同之處，才能更有效地利用示蹤技術(shù)在實驗動物模型中進行研究，造福人類的醫(yī)學(xué)研究事業(yè)。

脊髓損傷后，我們需要根據(jù)研究目的和神經(jīng)纖維解剖特點，來選擇合適的示蹤方法進行研究。本文將對常用的神經(jīng)束路示蹤方法、脊髓損傷易于累及的主要神經(jīng)纖維特點和在人與動物中的不同分布，以及示蹤技術(shù)在其研究中的應(yīng)用加以綜述。

1 常用示蹤技術(shù)

目前神經(jīng)束路示蹤技術(shù)常常被分為四代[6-8]。第一代是最傳統(tǒng)的染色方法，如Nissl法、Nauta法，需要損傷神經(jīng)，通過銀染變性的神經(jīng)纖維來進行束路示蹤[9-10]，揭示核團之間的聯(lián)系等，這類方法不能在活體動物上進行，故應(yīng)用受到很大限制。第二代和第三代神經(jīng)束路示蹤技術(shù)主要利用軸漿運輸?shù)脑淼靡詫崿F(xiàn)，示蹤劑被神經(jīng)元攝取后，根據(jù)軸漿流的方向，分為順行示蹤和逆行示蹤。其中第二代是利用逆行追蹤劑示蹤，如辣根過氧化物酶(horseradishper oxidase,HRP)、霍亂毒素B亞單位(choleratoxin subunit B,CTB)和多種熒光素等，注射到神經(jīng)纖維周圍被神經(jīng)末梢或軸突吸收后，逆軸漿流運輸?shù)缴窠?jīng)元胞體。第三代是利用順行追蹤劑示蹤，如HRP、生物素化葡聚糖胺(biotin dextran amines,BDA)和植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)等，注射到神經(jīng)元胞體周圍，被神經(jīng)元胞體吸收后，順軸漿流主動運輸?shù)缴窠?jīng)末梢。第四代是利用轉(zhuǎn)基因動物在特定神經(jīng)細(xì)胞中表達熒光蛋白來實現(xiàn)。第二代和第三代方法目前仍然是脊髓損傷實驗研究中的主要研究方法，其中一些示蹤劑還可以被熒光標(biāo)記或本身可以發(fā)出熒光，便于用熒光顯微鏡直接觀察。下面著重對目前在脊髓損傷與再生研究中最常用的逆行示蹤和順行示蹤進行綜述，并簡要介紹第四代技術(shù)在脊髓損傷實驗中的應(yīng)用。

1.1 逆行示蹤(retrograde tracing)

逆行示蹤劑是一類易于被損傷的神經(jīng)元軸突或纖維末梢吸收，經(jīng)過神經(jīng)纖維運輸?shù)竭_胞體，從而觀察神經(jīng)元形態(tài)、性質(zhì)的一類物質(zhì)。在軸突損傷與再生實驗中可以注射于損傷處遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維周圍，通過觀察統(tǒng)計脊髓、腦干、皮質(zhì)等胞體所在部位被逆行標(biāo)記的神經(jīng)元胞體，相對評估神經(jīng)纖維再生情況。

HRP是從辣根中提取的一組同工酶的混合物，SigmaⅣ型HRP的80%以上為C同工酶，故常用于追蹤，且效果良好。HRP在20世紀(jì)70年代初開始被用作逆行示蹤劑[6,11]，后來發(fā)現(xiàn)HRP也可以被神經(jīng)元胞體攝入，順行運輸至末梢部位，還可以跨過外周神經(jīng)節(jié)運輸，故后來也被用作順行示蹤劑和跨節(jié)示蹤劑。

熒光金(fluoro gold,FG)是目前脊髓損傷研究中常用的逆行示蹤劑，它標(biāo)記的神經(jīng)元不容易脫色，在活體動物中可以存在一年的時間[5]。將其注射于損傷部位以下，動物存活一段時間后，在脊髓、腦干、間腦和端腦等關(guān)注的部位切片，觀察標(biāo)記的神經(jīng)纖維和胞體，既可以在紫外線(323 nm)激發(fā)下直接用熒光顯微鏡觀察是否有金黃色熒光的陽性成分，也可以用抗熒光金的抗體免疫組化染色后觀察。

另外固藍(lán)(fast blue,FB)和雙咪基黃(diamidino yellow,DY)也是常用的逆行追蹤劑，前者顯示藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞核，后者顯示黃色熒光標(biāo)記的細(xì)胞質(zhì)，可用于雙標(biāo)。不過熒光素染料普遍分子小，易于擴散，在特異性標(biāo)記時注射劑量和部位必須控制好。羥化青(Dil)也被廣泛用于逆行和順行示蹤，在549 nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生發(fā)射波長為565 nm的紅色熒光[11]。

Roozbehi等[12]分別對低齡(40日齡)、中齡(5～6月齡)和高齡(28～29月齡)的大鼠進行同等程度的脊髓L1平面橫斷，并在L4平面注射逆行示蹤劑，結(jié)果顯示，在損傷后第8周，低齡和中齡鼠后肢運動功能評分(BBB評分)要明顯高于高齡鼠；在損傷后第10周時，Dil逆行示蹤發(fā)現(xiàn)低齡鼠有較多的再生神經(jīng)纖維穿過脊髓損傷區(qū)域。

CTB也是一種非常靈敏的示蹤劑，既可用于逆行示蹤[13]，也可用于順行示蹤[14]，還可以用于跨節(jié)示蹤[15]。B亞單位為霍亂毒素與細(xì)胞受體結(jié)合的亞單位，無毒性。標(biāo)記結(jié)果的可視化可以用抗CBT的抗體染色，通過免疫組織化學(xué)方法顯示出來；也可以用熒光素標(biāo)記CTB，在熒光顯微鏡下直接觀察。CTB常常與HRP交聯(lián)，形成CTB-HRP復(fù)合物，極大提高了作為示蹤劑的靈敏度[15]。

1.2 順行示蹤(anterograde tracing)

順行示蹤劑是一類被神經(jīng)元胞體吸收，經(jīng)過軸漿運輸?shù)竭_軸突末梢，從而觀察纖維形態(tài)、性質(zhì)的一類物質(zhì)。在軸突損傷與再生研究中，常會注射于神經(jīng)元胞體集中處，一般是某類特定纖維的起點，如大腦運動皮質(zhì)、中腦紅核等，通過觀察示蹤劑在遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維處的顯現(xiàn)，來研究這一類特定纖維軸突的再生情況。

BDA是最常用的順行示蹤劑[6]。Bayless等[16]通過注射BDA到成年大鼠眶前額皮質(zhì)，利用其順行示蹤原理，觀察背側(cè)紋狀體內(nèi)BDA陽性神經(jīng)纖維投射，發(fā)現(xiàn)雌性大鼠BDA陽性投射纖維顯著高于雄性，從而認(rèn)為在抑制性控制水平，存在性別的神經(jīng)解剖學(xué)差異。值得注意的是BDA有分子量為3000和10,000兩種分子形式，BDA(10,000)標(biāo)記軸突和神經(jīng)終末清楚準(zhǔn)確，用于順行示蹤；而BDA(3000)只能標(biāo)記神經(jīng)元胞體，不能用于順行示蹤[17]。BDA可視化可以通過直接結(jié)合熒光素標(biāo)記的卵白素或抗生物素抗體，在熒光顯微鏡下觀察；也可以用DAB方法染色，放大標(biāo)記效果，制作保存時間長久的切片。CTB和HRP等也可用于順行示蹤。

1.3 跨節(jié)示蹤(transganglionic tracing)

將示蹤劑注射于周圍神經(jīng)感覺末梢或感覺神經(jīng)干后，示蹤劑可以跨越外周神經(jīng)節(jié)被傳送到其中樞突的末梢，這類示蹤劑稱為跨節(jié)示蹤劑。

CTB和麥胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)是常用的跨節(jié)示蹤劑，常常與HRP交聯(lián)使用，提高其靈敏性。它們可以注射于坐骨神經(jīng)，經(jīng)軸漿運輸逆行至背根神經(jīng)節(jié)后，又沿中樞突進入脊髓，繼續(xù)沿脊髓背側(cè)索上行至薄束核，通過在薄束核觀察是否有示蹤劑陽性神經(jīng)纖維來判斷軸突的完整性[15]。生物素化的CTB(b-CTB)可以極大地提高CTB的攝取、轉(zhuǎn)運和敏感性，被證實也可以用于跨節(jié)示蹤[18]。

1.4 新技術(shù)的突破——轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的高速發(fā)展，研究者可以使用在特定神經(jīng)細(xì)胞中表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因動物來研究脊髓損傷后軸突的修復(fù)與再生[19]，目前較多用于對皮質(zhì)脊髓束再生的研究。Bareyre等[20]利用僅在皮質(zhì)脊髓束表達黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察皮質(zhì)脊髓束的腹側(cè)束和背外側(cè)束與運動神經(jīng)元間的聯(lián)系，并在完全切斷背側(cè)束后觀察腹側(cè)束和背外側(cè)束與神經(jīng)元之間聯(lián)系程度的變化。這種技術(shù)手段相比于前三代示蹤方法，不需要損傷實驗動物，標(biāo)記的神經(jīng)束路更準(zhǔn)確，能進行動態(tài)觀察，這一系列優(yōu)點使得它具有廣闊的應(yīng)用前景。但是Willenberg等[21]發(fā)現(xiàn)CST-YFP轉(zhuǎn)基因鼠的一部分表達YFP的神經(jīng)軸突并非來自于皮質(zhì)脊髓束，在網(wǎng)狀脊髓束、紅核脊髓束也發(fā)現(xiàn)YFP的表達，結(jié)合3D成像技術(shù)他們進一步證明這種轉(zhuǎn)基因鼠YFP基因的表達并不具有神經(jīng)束路特異性，在脊髓損傷后再生的研究工作中起到的作用也是有限的。這說明轉(zhuǎn)基因動物模型的應(yīng)用有待進一步研究。

2 脊髓損傷易累及的主要纖維及其在種屬間的不同分布

脊髓是外周神經(jīng)與高級神經(jīng)中樞相聯(lián)系的中繼站。脊髓白質(zhì)中分布有上行傳導(dǎo)纖維即感覺纖維、下行傳導(dǎo)纖維即運動纖維以及中間神經(jīng)元及其軸突，在脊髓損傷時，都會受到不同程度的損傷。

2.1 運動纖維

2.1.1 皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract)

皮質(zhì)脊髓束是哺乳動物脊髓內(nèi)最長的下行運動傳導(dǎo)束。皮質(zhì)脊髓束支配相應(yīng)骨骼肌的隨意運動，特別是前肢或手的精細(xì)運動，是脊髓中極其重要的一類傳導(dǎo)束。神經(jīng)束路示蹤技術(shù)在這類纖維的損傷和再生研究中發(fā)揮著重要作用。

皮質(zhì)脊髓束纖維主要起源于感覺運動皮層第Ⅴ層，也有一部分纖維來自皮質(zhì)其余部分。值得注意的是，它在不同哺乳類動物脊髓白質(zhì)中的分布有所不同。在靈長類動物和人，絕大多數(shù)皮質(zhì)脊髓束纖維自對側(cè)大腦皮質(zhì)發(fā)出，經(jīng)錐體交叉，行走于脊髓白質(zhì)外側(cè)，少數(shù)纖維不經(jīng)錐體交叉，行走于同側(cè)脊髓白質(zhì)腹外側(cè)和腹側(cè)。比如在恒河猴，皮質(zhì)脊髓側(cè)束占大約87%，而皮質(zhì)脊髓腹外側(cè)束和腹側(cè)束大約只占11%和2%[22]；在人類，皮質(zhì)脊髓側(cè)束占大約90%，而皮質(zhì)脊髓前外側(cè)束和前束分別占大約8%和2%[4]。而在嚙齒類動物，背側(cè)束是皮質(zhì)脊髓束的主要成分，自對側(cè)大腦皮質(zhì)發(fā)出，經(jīng)錐體交叉后下行于脊髓白質(zhì)背側(cè)索腹側(cè)；背外側(cè)束自大腦對側(cè)皮質(zhì)發(fā)出，行走于脊髓白質(zhì)外側(cè)索；腹側(cè)束自大腦同側(cè)皮質(zhì)發(fā)出，不經(jīng)錐體交叉，行走于脊髓白質(zhì)腹側(cè)索。后兩者只占總皮質(zhì)脊髓束纖維的很少比例，Bareyre等[20]觀察到小鼠脊髓胸段背側(cè)索的腹側(cè)有4800根左右皮質(zhì)脊髓束纖維，外側(cè)索有190根左右皮質(zhì)脊髓束纖維，腹側(cè)索有92根左右皮質(zhì)脊髓束纖維。但是根據(jù)Weidner等[23]和Bareyre等[20]的實驗結(jié)果，占少數(shù)的腹側(cè)束和背外側(cè)束在背側(cè)束受損時可能發(fā)揮重要的代償作用。Rosenzweig等[22]利用BDA順行示蹤技術(shù)證實，恒河猴皮質(zhì)脊髓束比大鼠具有更廣泛的雙側(cè)脊髓投射，推測提高這些廣泛的雙側(cè)投射的皮質(zhì)脊髓束纖維的發(fā)芽，或許能為脊髓損傷后的恢復(fù)提供新的治療靶點。皮質(zhì)脊髓束在不同動物之間的不同分布需引起實驗人員的注意。

在脊髓損傷的實驗動物模型，可以利用順行示蹤原理，將示蹤劑注射于感覺運動皮層，在損傷遠(yuǎn)側(cè)端觀察是否有神經(jīng)纖維跨過損傷區(qū)進入遠(yuǎn)側(cè)端；或者利用逆行示蹤原理，將示蹤劑注射于損傷區(qū)遠(yuǎn)側(cè)端后，在近側(cè)端胞體所在部位即感覺運動皮層觀察示蹤劑存在情況，以此研究判斷皮質(zhì)脊髓束的修復(fù)和再生情況。

近年來關(guān)于皮質(zhì)脊髓束軸突的修復(fù)和再生有大量研究，利用神經(jīng)束路示蹤技術(shù)，在許多動物模型證實了成年動物軸突損傷后再生的能力。Danilov等[24]研究發(fā)現(xiàn)，C4脊髓損傷成年小鼠敲除感覺運動皮層內(nèi)神經(jīng)元的同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)，有利于前肢運動功能的恢復(fù)。他們將BDA注射到感覺運動皮質(zhì)進行順行追蹤，發(fā)現(xiàn)在PTEN敲除鼠損傷脊髓的尾側(cè)端有更多的BDA標(biāo)記的軸突，同時其前肢運動功能的恢復(fù)也較對照組顯著，提示PTEN敲除促進皮質(zhì)脊髓束的再生和功能恢復(fù)。也有許多研究人員將成年恒河猴作為研究對象，證實在脊髓損傷后，皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)纖維可以再生[25-27]。例如Nakagawa等[27]應(yīng)用BDA示蹤技術(shù)對成年恒河猴脊髓損傷區(qū)域以下的皮質(zhì)脊髓束纖維的重建進行研究，他們在成年恒河猴脊髓的C7到C8節(jié)段之間造成半切損傷，通過順行示蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)脊髓束的神經(jīng)纖維發(fā)生重建，新生的神經(jīng)元優(yōu)先長入脊髓直接控制運動功能的區(qū)域，與此同時恒河猴上肢精細(xì)運動功能也逐漸恢復(fù)。

2.1.2 紅核脊髓束(rubrospinal tract)

紅核脊髓束起源于中腦紅核，交叉至對側(cè)，走行在脊髓外側(cè)索，主要調(diào)節(jié)運動功能。紅核脊髓束在不同動物分布有所不同。在靈長類動物和人，其分布在背外側(cè)索內(nèi)側(cè)，與皮質(zhì)脊髓側(cè)束有重疊，軸突主要位于頸膨大和腰膨大[28]；在嚙齒類動物，紅核脊髓束起源于紅核大細(xì)胞部，跨過中線，分布在脊髓外側(cè)索背側(cè)緣[29]。盡管尚無定論，但是普遍認(rèn)為人類和其他靈長類動物的紅核脊髓束已經(jīng)退化[2]，皮質(zhì)脊髓束取代了紅核脊髓束對運動的控制作用[30]。

因為紅核脊髓束在腦干和脊髓部分分布集中，容易被特異標(biāo)記，示蹤劑便于被注射和觀察；同時，通過損毀嚙齒類動物的脊髓外側(cè)索，可以全橫斷紅核脊髓束，因此，紅核脊髓束成為研究運動神經(jīng)元軸突再生的一個很具吸引力的模型系統(tǒng)[4]。很多學(xué)者采用紅核脊髓束研究脊髓損傷后軸突的再生，Mestre等[31]對不同種系的實驗大鼠進行T9脊髓損傷后，逆行示蹤紅核脊髓束并觀察其再生情況，結(jié)合BBB運動功能評分發(fā)現(xiàn)脊髓再生能力在Lewis大鼠明顯低于Sprague-Dawley大鼠和Fisher 344大鼠。

2.1.3 網(wǎng)狀脊髓束(reticulospinal tract)

網(wǎng)狀脊髓束起源于腦干網(wǎng)狀核，神經(jīng)纖維分布于脊髓腹側(cè)和腹外側(cè)廣大區(qū)域。網(wǎng)狀脊髓束能激活脊髓運動神經(jīng)元群而參與軀體運動和姿勢的維持。在較為低等的脊椎動物，由于沒有大腦皮層，網(wǎng)狀脊髓束便成為主要的運動通路。

因為網(wǎng)狀脊髓束與經(jīng)過腦干的其他束路廣泛重疊，所以順行標(biāo)記網(wǎng)狀脊髓束會同時標(biāo)記上腦干的前庭脊髓束和藍(lán)斑脊髓束等；逆行標(biāo)記時，也會標(biāo)記到其他束路，故網(wǎng)狀脊髓束不易于做特異束路的研究[4]。

Weishaupt等[32]研究發(fā)現(xiàn)，損傷大鼠皮質(zhì)脊髓背側(cè)束和紅核脊髓束而保留網(wǎng)狀脊髓束，6周后大鼠行為學(xué)有明顯恢復(fù)，然而束路示蹤結(jié)果顯示，皮質(zhì)脊髓束和紅核脊髓束并無明顯再生，網(wǎng)狀脊髓束很可能發(fā)揮了重要代償作用，雖然作用機制還不明確，但是對該束路的研究不容忽視。Filli等[33]利用順行示蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀脊髓束被切斷后，會自發(fā)地再生出大量樹枝狀的神經(jīng)纖維繞過損傷區(qū)域，伴隨脊髓損傷后運動功能的恢復(fù)。

2.2 感覺纖維

感覺纖維分布集中在背側(cè)索，容易特異性損傷。由于損傷不需要脊髓全橫斷，故損傷后動物存活率較高，而且可以明確闡述是否有中樞軸突的再生，所以是研究中樞感覺神經(jīng)元再生的一個代表性模型。

傳導(dǎo)精細(xì)觸覺和本體覺的感覺纖維經(jīng)脊髓背根節(jié)進入脊髓白質(zhì)，主要分布在脊髓背側(cè)索，上行到達腦干薄束核和楔束核后換元向更高級腦區(qū)上行。研究者可以通過在坐骨神經(jīng)注射追蹤劑CTB來觀察薄束核中是否有示蹤劑陽性的感覺纖維的軸突出現(xiàn)，以此判斷損毀是否完全。在這種示蹤方法中，示蹤劑需經(jīng)感覺神經(jīng)元周圍突即坐骨神經(jīng)攝取后向中樞運輸，跨過背根神經(jīng)節(jié)(感覺神經(jīng)元胞體所在部位)，被傳遞至位于脊髓的中樞突，所以被稱為跨節(jié)示蹤技術(shù)。背側(cè)索損毀的完全性還可以通過注射逆行示蹤劑到薄束核，然后觀察背根節(jié)是否有示蹤劑的出現(xiàn)[4]。

Bonner等[34]將神經(jīng)前體細(xì)胞移植入脊髓C1段背側(cè)索損傷部位，然后用熒光金從丘腦腹后外側(cè)核逆行標(biāo)記背側(cè)柱感覺神經(jīng)元，在坐骨神經(jīng)處注射CTB跨節(jié)標(biāo)記感覺纖維，發(fā)現(xiàn)熒光金逆行到達背側(cè)柱神經(jīng)元胞體，CTB標(biāo)記的軸突再生進入移植物；結(jié)合免疫電鏡和電生理技術(shù)，進一步證實移植的神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)元與宿主感覺神經(jīng)元軸突之間可以產(chǎn)生興奮性的突觸聯(lián)系。Hoeber等[35]將人胚胎干細(xì)胞起源的神經(jīng)前體細(xì)胞移植到脊髓背根撕裂處，并將CTB注射到坐骨神經(jīng)進行逆行追蹤，結(jié)合NF200免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)CTB隨著再生的宿主有髓感覺神經(jīng)纖維可以跨神經(jīng)節(jié)進入脊髓背根，達到脊髓背根深部；而IB4標(biāo)記的無髓感覺神經(jīng)纖維卻不能跨節(jié)進入脊髓背角，從而證實胚胎干細(xì)胞起源的神經(jīng)前體細(xì)胞支持有髓感覺神經(jīng)纖維的再生。

3 總結(jié)與展望

由于脊髓結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性與脊髓損傷研究的艱巨性，神經(jīng)束路示蹤技術(shù)在未來的研究中仍將發(fā)揮著不可替代的作用。第二代和第三代束路示蹤技術(shù)操作便于掌握，是脊髓損傷研究者常用的基本方法，為脊髓損傷的研究發(fā)揮了巨大作用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，我們希望能看到更多更好的轉(zhuǎn)基因示蹤動物模型能應(yīng)用到脊髓損傷實驗中。

實驗動物是用來研究脊髓損傷的重要實驗對象，但是它們的脊髓中神經(jīng)纖維的分布與人類又有所不同，只有充分了解這些異同之處，才能更有效地利用示蹤技術(shù)在實驗動物模型中進行研究，造福人類的醫(yī)學(xué)研究事業(yè)。

[1]Schwab JM,Brechtel K,Mueller CA,et al.Experimental strategies to promote spinal cord regeneration－an integrative perspective[J].Prog Neurobiol,2006,78(2):91-116.

[2]Fakhoury M.Spinal cord injury:overview of experimental approaches used to restore locomotor activity[J].Rev Neurosci, 2015,26(4):397-405.

[3]李建軍,周紅俊,洪毅,等.2002年北京市脊髓損傷發(fā)病率調(diào)查[J].中國康復(fù)理論與實踐,2004,10(7):412-413.

[4]Tuszynski MH,Steward O.Concepts and methods for the study of axonal regeneration in the CNS[J].Neuron,2012,74 (5):777-791.

[5]Okano H.Strategic approaches to regeneration of a damaged central nervous system[J].Cornea,2011,30(Suppl 1): S15-S18.

[6]Lanciego JL,Wouterlood FG.A half century of experimental neuroanatomical tracing[J].J Chem Neuroanat,2011,42(3): 157-183.

[7]Wouterlood FG.Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue[M].New York:Humanna Press,2014:51-86.

[8]Wouterlood FG,Bloem B,Mansvelder HD,et al.A fourth generation of neuroanatomical tracing techniques:exploiting the offspring of genetic engineering[J].J Neurosci Methods,2014, 235:331-348.

[9]Nauta WJ.Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system[J].Stain Technol,1952,27(3): 175-179.

[10]Fink RP,Heimer L.Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system[J].Brain Res,1967,4(4):369-374.

[11]朱賀,徐麗麗,李麗,等.常用神經(jīng)示蹤劑及其示蹤特點研究進展[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2009,4(4):288-290

[12]Roozbehi A,Joghataei MT,Bakhtiyari M,et al.Age-associated changes on axonal regeneration and functional outcome after spinal cord injury in rats[J].Acta Med Iran,2015,53(5): 281-286.

[13]Hanna A,Thompson DL,Hellenbrand DJ,et al.Sustained release of neurotrophin-3 via calcium phosphate-coated sutures promotes axonal regeneration after spinal cord injury[J].J Neurosci Res,2016,94(7):645-652.

[14]Dengler-Crish CM,Smith MA,Inman DM,et al.Anterograde transport blockade precedes deficits in retrograde transport in the visual projection of the DBA/2J mouse model of glaucoma[J].Front Neurosci,2014,8:290

[15]Kikukawa S,Kawaguchi S,Mizoguchi A,et al.Regenerationof dorsal column axons after spinal cord injury in young rats[J].Neurosci Lett,1998,249(2-3):135-138.

[16]Bayless DW,Daniel JM.Sex differences in myelin-associated protein levels within and density of projections between the orbital frontal cortex and dorsal striatum of adult rats:implications for inhibitory control[J].Neuroscience,2015,300: 286-296

[17]Reiner A,Veenman CL,Medina L,et al.Pathway tracing using biotinylated dextran amines[J].J Neurosci Methods,2000, 103(1):23-37.

[18]Lai BQ,Qiu XC,Zhang K,et al.Cholera toxin B subunit shows transneuronal tracing after injection in an injured sciatic nerve[J].PLoS One,2015,10(12):e0144030

[19]Buffelli M,Burgess RW,Feng G,et al.Genetic evidence that relative synaptic efficacy biases the outcome of synaptic competition[J].Nature,2003,424(6947):430-434.

[20]Bareyre FM,Kerschensteiner M,Misgeld T,et al.Transgenic labeling of the corticospinal tract for monitoring axonal responses to spinal cord injury[J].Nat Med,2005,11(12): 1355-1360.

[21]Willenberg R,Steward O.Non-specific labeling limits the utility of Cre-Lox bred CST-YFP mice for studies of corticospinal tractregeneration[J].JCompNeurol,2015,523(18): 2665-2682.

[22]Rosenzweig ES,Brock JH,Culbertson MD,et al.Extensive spinal decussation and bilateral termination of cervical corticospinal projections in Rhesus monkeys[J].J Comp Neurol, 2009,513(2):151-163.

[23]Weidner N,Ner A,Salimi N,et al.Spontaneous corticospinal axonal plasticity and functional recovery after adult central nervous system injury[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(6): 3513-3518.

[24]Danilov CA,Steward O.Conditional genetic deletion of PTEN after a spinal cord injury enhances regenerative growth of CST axons and motor function recovery in mice[J].Exp Neurol,2015,266:147-160.

[25]Freund P,Schmidlin E,Wannier T,et al.Anti-Nogo-A antibody treatment promotes recovery of manual dexterity after unilateral cervical lesion in adult primates-re-examination and extension of behavioral data[J].Eur J Neurosci,2009,29(5): 983-996.

[26]Hoogewoud F,Hamadjida A,Wyss AF,et al.Comparison of functional recovery of manual dexterity after unilateral spinal cord lesion or motor cortex lesion in adult macaque monkeys[J].Front Neurol,2013,4:101.

[27]Nakagawa H,Ninomiya1 T,Yamashita T,et al.Reorganization of corticospinal tract fibers after spinal cord injury in adult macaques[J].Sci Rep,2015,5:11986.

[28]Wannier-Morino P,Schmidlin E,Freund P,et al.Fate of rubrospinal neurons after unilateral section of the cervical spinal cord in adult macaque monkeys:effects of an antibody treatment neutralizing Nogo-A[J].Brain Res,2008,1217:96-109.

[29]Morris R,Tosolini AP,Goldstein JD,et al.Impaired arpeggio movement in skilled reaching by rubrospinal tract lesions in the rat:a behavioral/anatomical fractionation[J].J Neurotrauma,2011,28(12):2439-2451.

[30]Yang HS,Kwon HG,Hong JH,et al.The rubrospinal tract in the human brain:diffusion tensor imaging study[J].Neurosci Lett,2011,504(1):45-48.

[31]Mestre H,Ramirez M,Garcia E,et al.Lewis,Fischer 344, and Sprague-Dawley rats display differences in lipid peroxidation,motor recovery,and rubrospinal tract preservation after spinal cord injury[J].Front Neurol,2015,6:108.

[32]Weishaupt N,Hurd C,Wei DZ,et al.Reticulospinal plasticity after cervical spinal cord injury in the rat involves withdrawal of projections below the injury[J].Exp Neurol,2013,247: 241-249.

[33]Filli L,Engmann AK,Weinmann O,et al.Bridging the gap:a reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury[J].J Neurosci,2014,34(40):13399-13410.

[34]Bonner JF,Connors TM,Silverman WF,et al.Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across theinjuredspinalcord[J].JNeurosci,2011,31(12): 4675-4686.

[35]Hoeber L,Trolle C,Konig N,et al.Human embryonic stem cell derived progenitors assist functional sensory axon regeneration after dorsal root avulsion injury[J].Sci Rep,2015,5: 10666.

Application of Neural Tract Tracing Techniques in Study of Spinal Cord Injury and Regeneration(review)

LI Wan-yue1,DING Yu-meng1,WANG Xi2
1.First Pragade of Undergraduates,Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710032,China;2.Department of Neurobiology and Collaborative Innovation Center for Brain Science,School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710032,China

WANG Xi.E-mail:wangzh@fmmu.edu.cn

Spinal cord injury is one of the important field of neuroscience,and neural tract tracing techniques are important research tools.The neural fiber types in the spinal cord are complex,and there are some difference in structures between human beings and animals. This article reviewed different types of neural fibers closely related with spinal cord injury and regeneration,the difference between human beings and animals,and the application of neural tract tracing techniques in the study of spinal cord injury and regeneration.

spinal cord injury;neural tract tracing technique;retrograde tracing;anterograde tracing;transganglionic tracing;review

R651.2

A

1006-9771(2017)06-0657-05

2016-10-18

2016-11-08)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.06.008

國家自然科學(xué)基金項目(No.81171156)。

1.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅，陜西西安市710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室暨腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西西安市710032。作者簡介：李琬悅(1994-)，女，漢族，四川沐川縣人，本科生。通訊作者：王曦，女，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及修復(fù)。E-mail:wangzh@fmmu.edu.cn。