王長江，沈志強1,，金婷婷，武曰星，劉 慧，曲光剛

( 1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；3.華中農(nóng)業(yè)大學，湖北武漢 43000)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.03

犬新孢子蟲巨噬細胞轉(zhuǎn)移抑制因子(NcMIF)克隆表達 與其免疫調(diào)節(jié)作用鑒定

王長江2，沈志強1,2，金婷婷2，武曰星2，劉 慧3，曲光剛1*

( 1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；3.華中農(nóng)業(yè)大學，湖北武漢 43000)

通過原核系統(tǒng)表達犬新孢子蟲巨噬細胞轉(zhuǎn)移抑制因子(NcMIF)，并對該蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用進行分析。根據(jù)GenBank發(fā)表的序列，利用分子生物學軟件設(shè)計了一對特異性引物，通過RT-PCR方法擴增出NcMIF全基因，經(jīng)測序分析后，將NcMIF亞克隆到原核表達載體pET28a(+)，然后將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)中用IPTG進行誘導表達。利用HPLC對可溶性表達的重組NcMIF蛋白進行純化，去除內(nèi)毒素，最后對NcMIF的免疫調(diào)節(jié)作用進行鑒定。結(jié)果顯示，NcMIF沒有明顯的抗糖皮質(zhì)激素的免疫抑制作用，也沒有上調(diào)巨噬細胞TNF-α和NO表達量的作用，為進一步探究NcMIF的生物學功能及MIF在宿主免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

犬新孢子蟲；巨噬細胞轉(zhuǎn)移抑制因子；原核表達； 免疫調(diào)節(jié)

新孢子蟲病(Neosporiasis)是一種原生動物性疾病，并在世界范圍內(nèi)廣泛流行[1]。犬新孢子蟲(Neosporacanium)不僅能夠?qū)е掳ㄅ！⒀?、犬等孕畜流產(chǎn)、死胎和弱胎等嚴重繁殖障礙性疾病，還導致幼畜出現(xiàn)運動神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等癥狀，對養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失[2-3]。同時，在病人血清中也有檢測出新孢子蟲陽性的報道[4]，因此犬新孢子蟲也可能是人獸共患寄生蟲病。但是迄今為止，尚未有根除犬新孢子蟲的藥物和有效預防犬新孢子蟲的疫苗。

犬新孢子蟲感染過程中，天然免疫系統(tǒng)中的很多成分被激活，如巨噬細胞、樹突狀細胞等，這些被激活的細胞會釋放如IL-2、TNF-α等一系列細胞因子。哺乳動物的巨噬細胞轉(zhuǎn)移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)作為細胞因子的一種，與機體的敗血性休克有關(guān)[5]，具有調(diào)節(jié)巨噬細胞和淋巴細胞應(yīng)答[6]及內(nèi)分泌的功能[7]。它不僅能夠抑制單核巨噬細胞的隨機遷移和糖皮質(zhì)激素的抗炎癥效果，而且能夠抑制活化誘導的p53依賴性凋亡[8]。MIF還能夠上調(diào)免疫細胞TLR4受體和促炎癥細胞因子的表達，如TNF-α、IL-β、IL-6、IL-8和IL-12等，以及促進NO的分泌[9]。MIF能夠在多種類型的細胞中表達，包括單核細胞、淋巴巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞[10]。MIF被證實能夠與細胞表面的CD74受體結(jié)合[11]，同時也是趨化因子CXC受體非同源的配體[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，MIF保守的CXXC序列是氧化還原酶作用的功能域；而N端第二位的脯氨酸則是互變異構(gòu)酶活性的關(guān)鍵位點[13]。盡管MIF蛋白的催化活性與生物學功能之間的關(guān)系還不是很清楚，但是抑制MIF的互變異構(gòu)酶作用能夠降低LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生的TNF的量，提高敗血癥模型動物的成活率[14-15]。

近年來，許多的寄生蟲MIF同系物被分離到，這其中包括Strongyloides MIF、Trichinella spiralis MIF及Brugia malayi MIF等，并且這些MIF同系物具有和它們哺乳動物宿主相似的生物學功能和免疫調(diào)節(jié)作用[16-18]。本研究克隆了NcMIF基因，利用大腸埃希菌進行表達并對該蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用進行分析，為研究NcMIF在宿主免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種E.coliDH5α、BL21(DE3)及pMD-18T載體購自大連寶生物工程有限公司；pET28a(+)載體購自默克公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII、T4 DNA連接酶及PCR反應(yīng)試劑、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA Marker DL2000、卡那霉素(Kanamycin)均購自寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自NEB公司；BATEKE RNA提取試劑盒購自百泰克生物公司；Western blot發(fā)光底物購自Thermo公司；實驗用綿羊由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院繁育飼養(yǎng)；其他常用試劑均為分析純。

1.2 NcMIF基因的克隆與測序 基于NC1 NcMIF mRNA序列(NCLIV_042400，previously known as NC_LIV_113040，www.genedb.org)，利用分子生物學軟件PRIMER 5.0設(shè)計出一對特異性引物，通過PCR方法擴增出NcMIF基因。上游引物序列為5'-ATACATATGCCAAAGTGCATGATCTAC-3'，其中在5'端加入NdeI酶切位點，下游引物序列為5'-TAAAGCTTTTAGCCAAAGGTGCGGTC-3'，其中在5'端加入HindIII酶切位點。采用BATEKE RNA提取試劑盒從犬新孢子蟲中提取總RNA，取2 μg總RNA利用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以該cDNA為模板通過PCR方法擴增出NcMIF完整的閱讀框，PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，連接到pMD-18T載體，鑒定陽性克隆，送上海生工測序并對測序結(jié)果進行分析比較。

1.3 NcMIF蛋白的表達、內(nèi)毒素的去除及純化 將測序結(jié)果正確的基因片段亞克隆到pET28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a+NcMIF，并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)，以終濃度1 mmol/L IPTG 37 ℃進行誘導表達8 h。將誘導產(chǎn)物4 ℃條件下4000 ×g離心20 min，取上清，用裂解緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，PMSF 1 mmol/L，pH8.0)重懸細菌，-80 ℃/37 ℃反復凍融三次，然后用終濃度10 μg/mL的DNase/RNase 37 ℃消化30 min，然后4 ℃條件下20000 ×g離心20 min取上清，用于可溶性蛋白的純化。

將蛋白用Triton X-114處理，以去除內(nèi)毒素。首先將Triton X-114加到上一步分離到的上清液中至1%的終濃度，渦旋10 s，然后放置冰上5 min，渦旋之后37 ℃孵育10 min，最后20000 ×g，38 ℃離心2 min，收集上清，重復上述步驟7次，直到內(nèi)毒素濃度低于50 EU/mg。重組蛋白rNcMIF經(jīng)分子篩高壓液相色譜法(SECHPLC)分離純化，通過BCA方法測定純化后的蛋白濃度，并通過SDS-PAGE對蛋白純度和分子量進行分析。

1.4 免疫印跡分析 NcMIF樣品經(jīng)處理后在還原條件下用12% SDS-PAGE膠進行分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDV膜上，用3%的脫脂奶粉封閉PVDV膜后，在羊抗全新孢子蟲抗體(1∶200)中室溫下孵育1 h，然后用含有0.05% Tween20的PBS洗膜5次，每次5 min。將PVDV膜在1∶5000的羊抗兔IgG-HRP二抗中室溫條件下孵育1 h，然后用含有0.05% Tween20的PBS洗膜5次，每次5 min。用化學發(fā)光底物(SuperSignal?West Dura Exrended Duration Substrate)進行顯色并用成像儀拍照。

1.5 rNcMIF抗地塞米松免疫抑制功能鑒定 將500 μL大約含有1.5×105個RAW264.7巨噬細胞的DMEM細胞培養(yǎng)液平鋪于48孔細胞培養(yǎng)板中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。為判定NcMIFs對糖皮質(zhì)激素的反向調(diào)節(jié)作用，向含有或不含地塞米松(DEX)的培養(yǎng)基中分別加入遞增濃度的rNcMIF，將細胞預培養(yǎng)1 h，然后加入脂多糖至終濃度10 ng/mL，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，收集細胞培養(yǎng)液上清，4 ℃ 20000 ×g離心20 min。上清中的TNF-α和NO分別利用ELISA試劑盒(eBioscience Inc，San Diego，CA)和格里斯反應(yīng)方法進行檢測與分析。格里斯反應(yīng)分析如Straccia等[19]所述，即將150 μL樣品加入96孔板中，另外加入20 μL 1 μmol/L的磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(Sigma，St.Louis，MO)和30 μL含葡萄糖(Sigma，St.Louis，MO)、葡萄糖磷酸脫氫酶(Sigma，St.Louis，MO)和硝酸還原酶的混合液。在孔中混合半小時，然后分別加入20 μL 1%的磺胺和20 μL 0.1%N-(1-萘基)二鹽酸乙二胺(Sigma，St.Louis，MO)。孵育5 min后，使用酶標儀(Molecular Devices SpectraMaxPlus384，Ramsey，MN)分別在550 nm和650 nm處讀數(shù)。亞硝酸鹽的濃度由亞硝酸鈉標準曲線確定。

1.6 NcMIF對TNF-α和NO的免疫調(diào)節(jié)作用鑒定

為了評估NcMIF對TNF-α和NO的免疫調(diào)節(jié)作用，RAW264.7巨噬細胞用不同濃度的rNcMIF處理，然后加入脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)16 h，收集細胞上清，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?，同時設(shè)脂多糖空白組陰性對照，上清中的TNF-α和NO含量檢測方法同1.5。

2 結(jié) 果

2.1 NcMIF基因克隆 利用一對特異性的引物，通過PCR的方法擴增到一條約348 bp的產(chǎn)物，核酸電泳結(jié)果如圖1所示。將測序正確的NcMIF亞克隆到pET28a表達載體，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28a-NcMIF，并用Nde I和Hind III雙酶切鑒定，電泳結(jié)果如圖1第2、3和4泳道所示。

2.2 重組NcMIF的表達與純化 NcMIF重組大腸埃希菌BL21(DE3)在37 ℃用1 mmol/L IPTG進行誘導表達，經(jīng)過SDS-PAGE電泳驗證，蛋白在分子量11 kDa處均有條帶，且部分為可溶性表達。重組蛋白用SECHPLC進行純化，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定(圖2)。去除內(nèi)毒素后rNcMIF內(nèi)毒素含量低于0.5 EU/mL。

2.3 NcMIF的免疫印跡分析 NcMIF免疫印跡結(jié)果表明在11 kDa左右出現(xiàn)明顯的條帶(圖3)，說明rNcMIF能夠與犬新孢子蟲的陽性血清反應(yīng)。

2.4 rNcMIF抗地塞米松免疫抑制功能鑒定 在RAW264.7巨噬細胞中驗證rNcMIF抗地塞米松免疫抑制實驗結(jié)果表明，不同濃度的rNcMIF均沒有表現(xiàn)出抗糖皮質(zhì)激素免疫抑制作用來上調(diào)巨噬細胞TNF-α和NO產(chǎn)量的功能(圖4A、B)。

2.5 NcMIF對TNF-α和NO的免疫調(diào)節(jié)作用 RAW264.7巨噬細胞用不同濃度的rNcMIF處理，然后加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)16 h，收集細胞上清，檢測TNF-α和NO的含量變化，結(jié)果證明rNcMIF同樣也沒有上調(diào)巨噬細胞TNF-α和NO的表達(數(shù)據(jù)未提供)。

3 討 論

研究表明，馬拉布魯線蟲來源的MIF(BmMIF-1)與人類MIF一樣，具有控制巨噬細胞趨化運動的功能；在體外，BmMIF-1能夠增加巨噬細胞TNF-α與IL-8的表達；在體內(nèi)，BmMIF-1又通過誘導激活的巨噬細胞產(chǎn)生，促使T細胞向Th2細胞分化，使宿主產(chǎn)生Th2免疫應(yīng)答，最終抑制促炎癥細胞因子的產(chǎn)生，這成為拉布魯線蟲逃避宿主免疫應(yīng)答的重要手段[20-21]。這種免疫調(diào)節(jié)作用很可能與MIF的氧化還原酶和互變異構(gòu)酶兩種酶的功能有關(guān)。

本研究首次報道了犬新孢子蟲MIF同系物。通過分析發(fā)現(xiàn)，NcMIF具有哺乳動物MIF高度保守的氨基酸殘基，說明NcMIF可能具有與哺乳動物MIF相似的生物學活性。為進一步研究NcMIF的相關(guān)功能和生物學特性，本研究利用原核表達系統(tǒng)成功表達了可溶性的rNcMIF，并通過HPLC系統(tǒng)對蛋白進行了純化。通過對rNcMIF抗地塞米松免疫抑制功能和對TNF-α和NO的免疫調(diào)節(jié)作用進行研究，發(fā)現(xiàn)rNcMIF沒有上述的免疫調(diào)節(jié)功能，由于NcMIF的免疫調(diào)節(jié)功能與MIF的氧化還原酶和互變異構(gòu)酶活性密切相關(guān)，所以下一步將對NcMIF的酶進行鑒定。

關(guān)于NcMIF的其他生物學活性，以及NcMIF對在寄生蟲感染宿主、逃避宿主免疫系統(tǒng)中發(fā)揮的作用有待進一步研究，為有效防控犬新孢子蟲提供更多參考。

[1] Reichel M P, Ayanegui-Alcérreca M A, Gondim L F P,etal. What is the global economic impact ofNeosporacaninumin cattle-the billion dollar question[J]. International Journal for Parasitology, 2013, 43(2): 133-142.

[2] Ihara F, Nishimura M, Muroi Y,etal. Changes in neurotransmitter levels and expression of immediate early genes in brain of mice infected withNeosporacanium[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 23052.

[3] Peters M, Osmann C, Wohlsein P,etal. Neospora caninum abortion in a Malayan tapir (Tapirus indicus)[J]. Veterinary Parasitology, 2017, 239: 37-41.

[4] Fereig R M, AbouLaila M R, Mohamed S G A,etal. Serological detection and epidemiology ofNeosporacaniumand Cryptosporidium parvum antibodies in cattle in southern Egypt[J]. Acta tropica, 2016, 162: 206-211.

[5] Bernhagen J, Calandra T, Mitchell R A,etal. MIF is a pituitary-derived cytokine that potentiates lethal endotoxaemia[J]. Nature, 1993, 365(6448): 756-759.

[6] Calandra T, Bernhagen J, Mitchell R A,etal. The macrophage is an important and previously unrecognized source of macrophage migration inhibitory factor[J]. Journal of Experimental Medicine, 1994, 179(6): 1895-1902.

[7] Abe R, Peng T, Sailors J,etal. Regulation of the CTL response by macrophage migration inhibitory factor[J]. The Journal of Immunology, 2001, 166(2): 747-753.

[8] Roger T, Glauser M P, Calandra T. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) modulates innate immune responses induced by endotoxin and Gram-negative bacteria[J]. Journal of Endotoxin Research, 2001, 7(6): 456-460.

[9] Donnelly S C, Bucala R. Macrophage migration inhibitory factor: a regulator of glucocorticoid activity with a critical role in inflammatory disease[J]. Molecular Medicine Today, 1997, 3(11): 502-507.

[10] Calandra T, Roger T. Macrophage migration inhibitory factor: a regulator of innate immunity[J]. Nature Reviews Immunology, 2003, 3(10): 791-800.

[11] Leng L, Metz C N, Fang Y,etal. MIF signal transduction initiated by binding to CD74[J]. Journal of Experimental Medicine, 2003, 197(11): 1467-1476.

[12] Bernhagen J, Krohn R, Lue H,etal. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment[J]. Nature Medicine, 2007, 13(5): 587-596.

[13] Stamps S L, Fitzgerald M C, Whitman C P. Characterization of the role of the amino-terminal proline in the enzymatic activity catalyzed by macrophage migration inhibitory factor[J]. Biochemistry, 1998, 37(28): 10195-10202.

[14] Morand E F, Leech M, Bernhagen J. MIF: a new cytokine link between rheumatoid arthritis and atherosclerosis[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2006, 5(5): 399-411.

[15] Dabideen D R, Cheng K F, Aljabari B,etal. Phenolic hydrazones are potent inhibitors of macrophage migration inhibitory factor proinflammatory activity and survival improving agents in sepsis[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2007, 50(8): 1993-1997.

[16] Younis A E, Soblik H, Ajonina-Ekoti I,etal. Characterization of a secreted macrophage migration inhibitory factor homologue of the parasitic nematode Strongyloides acting at the parasite-host cell interface[J]. Microbes and Infection, 2012, 14(3): 279-289.

[17] Nisbet A J, Smith S K, Armstrong S,etal. Teladorsagia circumcincta: activation-associated secreted proteins in excretory/secretory products of fourth stage larvae are targets of early IgA responses in infected sheep[J]. Experimental Parasitology, 2010, 125(4): 329-337.

[18] Pastrana D V, Raghavan N, FitzGerald P,etal. Filarial nematode parasites secrete a homologue of the human cytokine macrophage migration inhibitory factor[J]. Infection and Immunity, 1998, 66(12): 5955-5963.

[19] Straccia M, Gresa-Arribas N, Dentesano G,etal. Pro-inflammatory gene expression and neurotoxic effects of activated microglia are attenuated by absence of CCAAT/enhancer binding protein β[J]. Journal of Neuroinflammation, 2011, 8(1): 156.

[20] Han C, Lin Y, Shan G,etal. Plasma concentration of malaria parasite-derived macrophage migration inhibitory factor in uncomplicated malaria patients correlates with parasitemia and disease severity[J]. Clinical and Vaccine Immunology, 2010, 17(10): 1524-1532.

[21] Shao D, Zhong X, Zhou Y F,etal. Structural and functional comparison of MIF ortholog from Plasmodium yoelii with MIF from its rodent host[J]. Molecular Immunology, 2010, 47(4): 726-737.

Cloning,ExpressionandImmunoregulatoryActivitiesIdentificationofMacrophageMigrationInhibitoryFactorDerivedfromNeosporacanium

WANG Chang-jiang2，SHEN Zhi-qiang1,2, JIN Ting-ting2，WU Yue-xing2，LIU Hui3，QU Guang-gang1*

(1.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou，Shandong256600,China; 2.ShandongLvDuBio-ScienceandTechnologyCo.,LTD,Binzhou,Shandong256600,China; 3.HuazhongAgricultureUniversity,Wuhan430000,China)

WANGChang-jiang,E-mail：guanggangqu@163.com

To express macrophage migration inhibitory factor (NcMIF) ofNeosporacaniumby prokaryotic expression system and identify the enzyme activities of NcMIF, the NcMIF complete open reading frame (ORF) sequence was obtained based on sequences reported in the GenBank. And one pair of specific primers was designed to amplify the NcMIF gene from cDNA by using polymerase chain reaction (PCR) and the NcMIF ORF was sequenced and subcloned into pET28a(+). The recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21 and induced by IPTG. The recombinant protein was expressed in soluble way and purified by HPLC and endotoxin was removed from the recombinant protein and native proteins. Results showed that NcMIF had no effect to counter-regulate glucocorticoid activity in macrophages or to regulate TNF-α and nitric oxide production by macrophages. It will establish the foundation to explore the biological function of NcMIF and its role in host immune regulation of MIF.

Neosporacanium; macrophage migration inhibitory factor; prokaryotic expression; immunoregulatory

2017-06-26

A

1002-1280 (2017) 10-0018-06

S852.7

山東省自然科學基金資助項目(ZR2013CQ004)

王長江，碩士，從事病原源性免疫調(diào)節(jié)因子免疫調(diào)節(jié)功能的研究。

曲光剛。E-mail：guanggangqu@163.com

(編輯：陳希)