宋國華，陳朝陽，劉田福，龐文彪，高繼萍，張銳虎，劉茂林，樊林花

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原030001)

專題研究

中國地鼠線粒體基因組與微衛(wèi)星遺傳標記的研究

宋國華，陳朝陽，劉田福，龐文彪，高繼萍，張銳虎，劉茂林，樊林花

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原030001)

中國地鼠在生物醫(yī)學研究中占有重要的地位，但中國地鼠的分子遺傳標記研究尚少。本研究運用生物信息學和比較基因組學等方法分析了中國地鼠的線粒體基因組的堿基組成、基因組結構、基因進化等特征，為中國地鼠應用于人類疾病動物模型提供基因組數(shù)據(jù)。建立了中國地鼠近交系遺傳質量控制體系，為中國地鼠種質資源科學評估、合理開發(fā)利用奠定了基礎。

中國地鼠；線粒體基因組；分子進化；微衛(wèi)星；遺傳檢測

1 研究背景

中國地鼠作為源于我國的特色實驗動物資源，在生命科學研究中占有重要地位。它的染色體大、數(shù)量少(2n=22)，易于辨認，是研究染色體畸變的良好材料，也可進行輻射遺傳、細胞遺傳等研究；它有一對易于翻出的頰囊，是微循環(huán)研究和腫瘤移植的理想部位；通過近親交配而具有的遺傳性糖尿病傾向，更是理想的實驗動物模型[1]。上世紀八十年代初，山西醫(yī)科大學薄家璐教授等從北京郊區(qū)捕捉野生地鼠，在國內(nèi)首次培育出中國地鼠近交群體[2]。

在生命科學研究中使用的實驗動物不但應有嚴格的微生物控制，還應有明確、穩(wěn)定的遺傳背景數(shù)據(jù)供研究者參考使用。在嚙齒類實驗動物中，有關大小鼠的各種生物學性狀和基因組學研究非常深入和廣泛，但中國地鼠的遺傳性狀、基因組等基礎資料報道很少。過去關于中國地鼠的研究主要集中在染色體核型、RAPD遺傳標記、繁育等方面，其線粒體基因組、分子進化、微衛(wèi)星遺傳標記尚屬空白[3]，這些工作的缺失，嚴重制約了近交系中國地鼠在生物醫(yī)學領域的應用。提供可供參考使用的中國地鼠的基因組數(shù)據(jù)，建立可靠的遺傳質量檢測方法，顯得非常迫切和必要。

線粒體基因組是核外遺傳系統(tǒng)，具有小型性、多態(tài)性和自主性等特點。目前研究表明許多疾病與線粒體基因組的蛋白編碼基因變異有關，已深入研究到生物的發(fā)育、衰老、腫瘤、代謝、疾病、遺傳以及進化等領域[4,5]。中國地鼠在醫(yī)學領域有許多重要事件和它有密切關系，因此開展其線粒體基因組結構和功能的研究，對于深入了解中國地鼠發(fā)育過程中核內(nèi)基因與核外基因遺傳信息的相互作用、基因表達與調(diào)控的分子機理及其與母性遺傳性狀相關的遺傳研究具有重要意義[4，6]。對中國地鼠和其近緣種的線粒體DNA比較研究，將為中國地鼠的起源、種系演化以及特定遺傳結構的形成原因提供重要證據(jù)，與哺乳類動物線粒體DNA的系統(tǒng)分析還將對哺乳類動物的系統(tǒng)演化提供一定證據(jù)[7-9]。

常用的實驗動物遺傳檢測方法有形態(tài)學方法、免疫學方法、生物化學標記方法等，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，分子遺傳標記技術在實驗動物的遺傳檢測中得以廣泛應用，其中包括限制性酶切片段多態(tài)性標記(RFLPs)、隨機擴增多態(tài)性DNA 標記(RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性標記(AFLP)、微衛(wèi)星DNA標記(Microsatellite DNA)、單核苷酸多態(tài)性標記(SNPs)等[10]。微衛(wèi)星DNA標記多態(tài)性豐富，均勻分布于哺乳動物基因組，檢測技術成熟，穩(wěn)定性好，重復性高，可比性強，已成為目前動物遺傳多樣性評估和遺傳監(jiān)測研究的首選標記[11-13]。

因此本課題以中國地鼠為研究材料，對其線粒體全基因組序列進行研究，從分子水平確定其在嚙齒類動物中的進化地位。同時建立中國地鼠微衛(wèi)星遺傳檢測體系，為種質資源保護、群體變異和遺傳連鎖圖譜構建等提供研究手段。

2 研究目的

中國地鼠作為實驗動物，其遺傳背景和遺傳概貌需要清楚明確，目前還沒有進行系統(tǒng)化和規(guī)范化研究。本研究參照近緣物種的線粒體基因組，設計特異引物，應用降落PCR技術和生物信息學方法獲得中國地鼠線粒體全基因組序列，分析其37個基因的結構和特征；從分子水平對嚙齒類動物的分類及親緣關系進行研究，對使用中國地鼠開辟新的動物疾病模型途徑和研究多種疾病發(fā)病機制具有重要價值。針對遺傳質量檢測技術，采用構建文庫的方法獲得中國地鼠微衛(wèi)星位點并開發(fā)微衛(wèi)星引物，并對SYB1近交群體進行檢測，建立中國地鼠近交系遺傳質量控制體系，為中國地鼠這一獨特的實驗動物種質資源科學評估、妥善保存和合理開發(fā)利用提供了新型的遺傳標記。

3 創(chuàng)新點

本項目系統(tǒng)研究了中國地鼠線粒體全基因組和微衛(wèi)星遺傳標記，首次測定中國地鼠線粒體全基因組序列，建立了一套中國地鼠線粒體基因組及相應序列的測定方法，比較分析了中國地鼠與金黃地鼠、大鼠、小鼠、田鼠的線粒體的基因組結構，闡明其基因組成、基因排列和基因結構特點，發(fā)現(xiàn)與金黃地鼠的序列同源性較高，結構相似。利用GenBank中的線粒體序列，分析其序列差異，構建分子系統(tǒng)關系，探討中國地鼠、金黃地鼠、田鼠、小鼠、大鼠的進化關系。成功構建了中國地鼠基因組微衛(wèi)星富集文庫，篩選出一套多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標記；并對SYB1近交系中國地鼠進行檢測，為中國地鼠遺傳圖譜構建、遺傳監(jiān)測研究奠定了基礎。

4 討論

本研究應用生物信息學技術對線粒體基因組的13個蛋白編碼基因、2個rRNA基因、22個tRNA基因和1個D-loop區(qū)進行基因定位，分析37個基因結構和特征；利用GenBank所得到的線粒體序列，分析中國地鼠、金黃地鼠、田鼠、小鼠、大鼠的序列差異，構建分子系統(tǒng)關系，從比較醫(yī)學角度為中國地鼠在生物醫(yī)學應用研究提供理論依據(jù)。本研究建立的微衛(wèi)星遺傳檢測方法與形態(tài)學檢測法、生化標記檢測法、免疫學技術檢測法等傳統(tǒng)的遺傳檢測方法相比，檢測結果更準確、更可靠。尤其針對近交系動物進行檢測，如果用一定數(shù)量的微衛(wèi)星引物進行擴增，基因型均表現(xiàn)相同，說明基因位點純合，達到近交系的要求；如果基因型表現(xiàn)不同，說明在繁育過程中可能發(fā)生了遺傳變異或遺傳污染[14,15]。

因此，應用微衛(wèi)星標記方法更適用于近交系動物的遺傳檢測，可以進行純合位點的判定，還能分析基因位點的變異情況。本研究獲得的中國地鼠線粒體微衛(wèi)星遺傳質量控制體系不僅豐富和完善了我國實驗動物質量標準體系，還為中國地鼠的繁育與開發(fā)利用等提供了技術支撐。

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Study of mitochondrial genomes and molecular genetic marker of microsatellite in chinese hamster

SONG Guo-hua，CHEN Zhao-yang，LIU Tian-fu，PANG Wen-biao， Gao Ji-ping，ZHANG Rui-hu，LIU Mao-lin，F(xiàn)AN Lin-hua

(Shanxi Medical University，Laboratory Animal Center，Shanxi Key Laboratory of Experimental Animal Science and Human Disease Animal Model，Taiyuan 030001，China)

Chinese hamster is an important laboratory animal in medical and biological researches，but the molecular genetic markers research was rarely reported．In our study the base composition，gene structure，genetic evolution and other characteristics of mitochondrial genome of Chinese hamster were analyzed using the methods of bioinformatics and comparative genomics，genetic quality detection system of Chinese hamster were also established．These results would supply genome data for animal models of human diseases，and lay the foundation for scientific evaluation and reasonable utilization．

Chinese hamster；Mitochondrial genome；Phylogenetic relationship；microsatellite；Genetic monitoring

山西省實驗動物專項資金(2005k01,2009k02)。

宋國華(1973-)，女，教授，研究方向：實驗動物遺傳標記與疾病動物模型。E-mail:ghsongg@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0004-03

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.002

2016-10-29