張引紅，王春芳，郭 民，張銳虎，陳朝陽

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001)

研究報告

宮腔注射無水乙醇對小鼠動情周期的影響

張引紅，王春芳，郭 民，張銳虎，陳朝陽*

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001)

目的 探討宮腔內(nèi)注射無水乙醇對小鼠動情周期的影響。方法 利用陰道脫落細胞染色法選擇動情期規(guī)律的小鼠20只，宮腔注射無水乙醇，術(shù)后第一個動情周期內(nèi)每日測定其動情周期，隨機擇10只在第二個動情周期每2 h測一次，觀察動情周期的改變程度。 結(jié)果 實驗小鼠宮腔注射無水乙醇后動情周期整體發(fā)生大幅度延長，且動情期、動情前期等各期時間均發(fā)生了不同程度的紊亂。結(jié)論 本實驗通過觀測無水乙醇損傷子宮后小鼠動情周期發(fā)生紊亂的現(xiàn)象，為臨床無水乙醇的使用提供一定的實驗基礎(chǔ)。

無水乙醇；宮腔注射；動情周期

作為一種采購方便、價格低廉且無毒的化學試劑，乙醇因其對細胞、組織的脫水和蛋白質(zhì)變性作用在科研實驗及臨床中被廣泛應(yīng)用[1]。臨床治療中，常常利用無水乙醇直接接觸異位、增生等異常的組織或器官進行損傷以達到治療目的，尤以生殖系統(tǒng)疾病最為常見，如子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜異位、卵巢囊腫，以及子宮內(nèi)膜炎引起的子宮內(nèi)膜異常出血等[2,3]。但針對無水乙醇在治療過程中可能對生殖系統(tǒng)帶來的傷害，對內(nèi)分泌系統(tǒng)可能存在的影響，暫無人進一步研究。規(guī)律的動情期作為小鼠生殖系統(tǒng)正常的一個重要指標，有著不可忽視的意義。本實驗擬通過觀測無水乙醇損傷子宮后小鼠動情期變化，為臨床無水乙醇的使用提供一定的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠，SPF級，雌性，6～8周齡，體重20～22 g，20只，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(晉)2015-0001]。飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物實驗室[SYXK(晉)2015-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(25±2)℃和濕度(55±2)%，自由采食飲水，光照/黑暗各12 h。

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇(北京化工廠);醇溶性伊紅染液(上海榕柏生物技術(shù)有限公司);戊巴比妥鈉(Ceres Chemical);生理鹽水(山東華魯制藥有限公司);研究級正置顯微鏡(Olympus IX51)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠動情周期觀察

每日上午8∶00做陰道脫落細胞涂片檢查。將裝有生理鹽水的一次性灌胃針輕輕插入到小鼠陰道口，注入0.1 mL生理鹽水沖洗陰道，用載玻片接取溢出的陰道沖洗液，并涂抹均勻，晾干。用95%乙醇固定5 min，伊紅染色液染色l min[1]。200倍光鏡觀察陰道脫落細胞染色情況并記錄。連續(xù)觀察三個動情周期。剔除動情期不規(guī)律者。

1.3.2 宮腔灌注無水乙醇實驗

擇動情期規(guī)律小鼠在動情期當日進行實驗。用1.5 %戊巴比妥鈉麻醉實驗小鼠，劑量為75 mg/kg。將小鼠固定在實驗臺上，75%乙醇對小鼠腹部進行消毒，尿道口上端約1 cm處縱行剪開皮膚，切口約1 cm。逐層分離進入腹腔。撥離膀胱，可見Y狀子宮。用無齒鑷將子宮暴露于體外，周圍覆蓋無菌紗布。將子宮近輸卵管端及近子宮頸端分別用血管夾夾住，拉直子宮，從近宮頸口插入1 mL注射器針頭，緩慢注射無水乙醇至子宮充盈，等候3 min，吸走乙醇?；謴?fù)子宮位置，用生理鹽水沖洗腹腔。取出另一側(cè)子宮，操作同上。關(guān)腹，逐層縫合[1]。

1.3.3 結(jié)果觀察

術(shù)后次日繼續(xù)測定實驗小鼠動情周期，測定時間依舊為每日上午8∶00，測定頻率為每日一次，將各期觀察到的次數(shù)作為存在天數(shù)并記錄。分析記錄與術(shù)前動情周期及相關(guān)文獻[8]持續(xù)時間的區(qū)別及各期變化。

參考第一周測定結(jié)果及相關(guān)文獻記錄，隨機選擇10只小鼠將動情周期測定時間變更為每2 h測一次(計數(shù)方法為測到一次算2 h)，進一步明確各期變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠動情周期

小鼠具有規(guī)律的動情周期，約為4～5 d,周期內(nèi)各期特征如下：(1)動情前期：大多為橢圓形的有核上皮細胞(見圖1A)，持續(xù)時間較短；(2)動情期∶90%以上為無核角化細胞(見圖1B)；(3)動情后期：為無核角化細胞和白細胞的混合狀態(tài)(見圖1C)；(4)動情間期∶90%以上為白細胞(見圖1D)。

2.2 術(shù)后小鼠周期狀況

2.2.1 術(shù)后第一個動情周期內(nèi)狀態(tài)

計數(shù)方法為觀察到一次算為1 d。

術(shù)后小鼠最明顯的狀況為大部分動情期延長至2～3 d，個別甚至高達4～5 d，導致整體的動情周期被大幅度延遲。另外，術(shù)后動情周期比較紊亂，大部分小鼠動情后期出現(xiàn)2～3 d，超過文獻記錄[8]12 h；1只小鼠在經(jīng)歷了3 d動情期和3 d動情后期后，跳過動情間期和動情前期，直接進入新的動情期；四分之一的小鼠連續(xù)4～5 d處于動情間期；超過二分之一的小鼠動情后期結(jié)束越過動情前期，直接進入動情間期。具體情況參見表1。

2.2.2 術(shù)后第二個動情周期狀況

術(shù)后第二個動情周期開始，隨機選擇10只小鼠每隔2 h測定一次動情周期并記錄。發(fā)現(xiàn)術(shù)后動情期、動情后期均存在不同程度的時間延長，尤以動情期延長最為明顯。另外也觀察到大部分小鼠的動情前期還是存在的，只是比文獻顯示時間相對縮短，因此測定頻率較低的時候容易錯過。也有個別小鼠未觀察到動情期。具體情況參見表2。

3 討論

無水乙醇能使細胞脫水，細胞膜蛋白質(zhì)變性、凝固、壞死，臨床上廣泛的用于治療月經(jīng)過多、子宮內(nèi)膜增生、子宮肌瘤、卵巢囊腫、甲狀腺結(jié)節(jié)、肝腎囊腫、肝癌及肺癌等[2-7]。同時，臨床治療中無水乙醇使用對醫(yī)療設(shè)備配置、醫(yī)護人員技能均要求較低，治療費用較少，安全性容易控制，因此得到了患者及醫(yī)生的普遍認可并逐步成為首選[13]。

注：(A)動情前期；(B)動情期；(C)動情后期；(D)動情間期。圖1 小鼠不同動情周期陰道涂片(×200)Note.(A)Preoestrus stage；(B)Estrus stage；(C)Meterus stage；(D)Diestrus stage.Fig.1 Vaginal smears of the mice at different stages of estrous cycle

鼠號Number動情期Estrusstage動情后期Meterusstage動情間期Diestrusstage動情前期Preoestrusstage動情周期Estruscycle141207232319332308421508533006631509742208823308921407105131101133208123240913413191432207153230816232181722408183230819312172031318

表2 術(shù)后第二個動情周期狀況(h)

周云清等[10]在良性月經(jīng)過多患者宮腔內(nèi)注射無水乙醇的方法，達到減少月經(jīng)量，迅速止血的效果。該方法操作簡單、療效高，且不需要特殊的儀器及操作訓練。但該方法的遠期療效、副作用、復(fù)發(fā)率、失敗原因等也都需要進一步探討。劉家開等[11]在超聲介導下通過腹部穿刺注射無水乙醇對卵巢囊腫患者進行治療，成功率高達98%，術(shù)后并發(fā)癥及復(fù)發(fā)率均較低。李秀娥等[12]在超聲引導下經(jīng)皮下子宮肌瘤內(nèi)注射無水乙醇，分別在術(shù)后6個月、12個月觀察子宮體積、肌瘤體積、內(nèi)部血流臨床癥狀等，發(fā)現(xiàn)子宮體積、肌瘤體積縮小，肌瘤內(nèi)部及周邊血流明顯減少等癥狀，同時月經(jīng)量明顯減少，部分出現(xiàn)陰道出血及分泌物增多等副作用。石洪柱等在超聲引導下宮腔注射無水乙醇治療子宮內(nèi)膜增殖癥，成功率100%，副作用較低，且短時間內(nèi)均消失[4]。另外，同類治療臨床案例均有多次報道[5-7,13]，但對術(shù)后生殖系統(tǒng)、月經(jīng)周期、性激素等的影響均未進一步研究。同時，部分案例報道中患者要求為無生育計劃者，大幅度縮小了無水乙醇法治療受用者范圍，忽視了無水乙醇對患者的生殖系統(tǒng)可能帶來的影響[4,5]。

雌性小鼠具有規(guī)律的動情周期，大約為4～5 d，在此周期內(nèi)，由于受到雌激素、孕激素的影響，小鼠生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生一系列組織學和生理學的變化[8,9]。陰道黏膜在雌激素及孕激素的作用下發(fā)生陰道黏膜細胞增生、角化、脫落的一系列活動[8]。在生殖研究類的以雌性小鼠為對象科研實驗中，規(guī)律的動情周期作為生殖系統(tǒng)正常運轉(zhuǎn)的重要指標之一，常常影響到實驗的發(fā)展及進程。無水乙醇作為使用便捷用且創(chuàng)傷較小的一種治療手段，伴隨著日漸發(fā)達的超聲引導技術(shù)，越來越多被應(yīng)用到臨床相關(guān)疾病的靶向治療當中。然而，該方法可能會帶來的副作用，尤其是不可逆的損傷，必須得到相關(guān)的重視，而不是忽視，或者選擇性回避。

本實驗通過小鼠宮腔注射無水乙醇，同時在實驗過程中通過各種手段避免無水乙醇損傷卵巢、輸卵管，保證其單一作用于小鼠子宮，從而進一步觀察無水乙醇損傷子宮對小鼠動情周期的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗小鼠的動情周期都發(fā)生了不同程度的延長，其動情各期也分別發(fā)生了不同程度的紊亂，猜測可能由于子宮受到損傷，影響了相關(guān)激素分泌，導致無法進行正常的循環(huán)。初步證明無水乙醇可能對實驗小鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生了負面的影響，為臨床使用無水乙醇提供了一定的選擇思路，但對于該影響是否可逆，以及深層的紊亂影響機制，仍需進一步研究。

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Effects of intrauterine injection of ethanol on estrous cycle in mice

ZHANG Yin-Hong，WANG Chun-fang，GUO Min，ZHANG Rui-hu，CHEN Zhao-yang*

(Department of Laboratory Animal Science, Shanxi Key Laboratory of Laboratory Animal and Animal Model of Human Diseases，Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

Objective To investigate the effect of uterine cavity injection of absolute ethanol on estrous cycle in mice.Methods Twenty mice with regular estrous cycle were selected by vaginal exfoliated cells staining, and then were injected absolute ethanol into their uterine cavity. The estrous cycle was observed and recorded every day. Ten mice were selected randomly to observe the changes of second estrous cycle every two hours.Results After the injection of absolute ethanol into the uterine cavity of the experimental mice, the estrous cycle was greatly prolonged, and the various degree of disorder was observed in estrus and pre-estrus. Conclusions The disorder was observed in estrous cycle of mice after the injection of absolute ethanol, which maybe provides some references for clinical use of absolute ethanol.

Ethanol；Intrauterine injection；Estrous cycle

山西省實驗動物資源共享服務(wù)平臺建設(shè)(201605D121019)；山西省重點實驗室建設(shè)項目(2015012001-09)。

張引紅(1972-), 女, 碩士生，實驗師, 研究方向:實驗動物學。E-mail:sxndzyh@163.com

陳朝陽(1972-), 男,副教授, 研究方向:實驗動物學。E-mail: ccytycn@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0051-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.012

2017-01-20