朱 蕾 徐仁伵

(南昌大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科，江西 南昌 330006)

·綜述·

蛋白質組學在常見神經(jīng)退行性疾病中的臨床研究進展

朱 蕾 徐仁伵

(南昌大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科，江西 南昌 330006)

神經(jīng)退行性疾病；蛋白質組學；阿爾茨海默?。慌两鹕。缓嗤㈩D氏?。患∥s性脊髓側索硬化

神經(jīng)退行性疾病是癥狀多樣化的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常見的有阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓氏病(HD)、肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)及許多其他不常見的、有功能障礙的疾病〔1〕。盡管已經(jīng)證明基因突變與這些疾病密切相關，但大多數(shù)仍具有一定的年齡依賴性〔2〕。雖然神經(jīng)退行性疾病起源不同，但神經(jīng)退行性疾病都以神經(jīng)元退化引起的進展性的運動、感覺、知覺及相關的認知和行為障礙為特征〔3〕?；蛲蛔兒屯庠匆蛩毓餐瑢е律窠?jīng)退行性疾病的發(fā)生和進展，其發(fā)病機制復雜多樣〔4〕。常見的神經(jīng)退行性疾病相關的基因突變導致蛋白質錯誤折疊，病變蛋白質在大腦皮層、基底神經(jīng)節(jié)、小腦、腦干及運動系統(tǒng)的神經(jīng)細胞內形成蛋白質聚集和包涵體〔5〕。然而，導致蛋白質聚集的分子途徑在很大程度上是未知的。盡管特定的基因異常會導致神經(jīng)退化，但是遺傳性的基因突變并不是神經(jīng)細胞死亡的唯一原因，現(xiàn)有證據(jù)表明，外源性因素以及基因變異共同導致神經(jīng)元細胞的死亡〔6〕。至今導致神經(jīng)退化的根本機制目前是不明確的。本文就蛋白質組學在神經(jīng)退行性疾病中的研究進展進行綜述。

1 神經(jīng)退行性疾病概述

不同的神經(jīng)退行性疾病的癥狀、發(fā)病年齡和疾病進展特點各不相同，但是很多疾病在早期階段經(jīng)常出現(xiàn)類似的癥狀。

AD最常見的臨床表現(xiàn)發(fā)生在生命的后期，但遺傳性早發(fā)型AD也是被證實存在的〔7〕。淀粉樣前體蛋白(APP)、早衰蛋白(PS)1及PS2與早發(fā)性家族型AD相關〔8〕。這些突變的基因導致細胞產(chǎn)生對神經(jīng)元細胞具有毒性的β淀粉樣肽(β-amyloid)42〔9〕。AD的神經(jīng)病理特點是神經(jīng)原纖維纏結(NFTs)和細胞外老年斑(SPs)。NFTs是微管相關tau蛋白(MAPT)過度磷酸化形式的〔10〕。SPs由多個蛋白質及β-amyloid與局部炎癥反應形成的。NFTs與SPs導致神經(jīng)退化的確切作用目前尚不清楚。進展的AD主要在海馬體、大腦皮質區(qū)域的神經(jīng)元丟失〔11〕。tau蛋白的突變也伴隨著NFTs和17號染色體常染色體顯性遺傳的額顳葉癡呆(FTD)〔12〕。FTD是癡呆在所有年齡組有臨床特征的第3個主要原因〔13〕。

PD是除了AD最常見的神經(jīng)退行性疾病，特點是神經(jīng)元多巴胺(DA)的缺失及黑質密部中形成的路易小體(LB)〔14〕。 PD大多是散發(fā)的，家族遺傳型與Parkin(PARK2)、PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)、α-synuclein(PARK1和PARK4)、泛素羧基端水解酶-L1基因(PARK5)和富亮氨酸重復激酶2(PARK8)突變有關〔15〕。在路易體癡呆(DLB)中，LB廣泛表達于大腦皮質神經(jīng)元亞群內〔16〕。

與PD相比，明確的家族史可以在本質上確定所有情況下的HD〔17〕。HD表現(xiàn)為DNA復制錯誤與亨廷頓蛋白基因的胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)三核苷酸重復序列動態(tài)突變發(fā)生病理性擴增引起多聚谷氨酰胺鏈異常延長導致的神經(jīng)退行性疾病〔18〕。

ALS其特點是皮層、腦干和脊髓運動神經(jīng)元功能損傷，由于細胞縐縮和軸突腫脹導致的神經(jīng)元細胞廣泛死亡〔19〕。不到10%的ALS為家族性，其中約10%～20%有超氧化物歧化酶(SOD)1基因突變，參與調節(jié)自由基的形成〔20〕。遺傳研究表明，SOD1基因突變對運動神經(jīng)元有選擇性毒性作用〔21〕。

最后，還有一系列的早發(fā)型常染色體隱性疾病，主要影響下運動神經(jīng)元，稱為脊髓性肌萎縮，主要表現(xiàn)為進行性肌無力和肌萎縮。絕大多數(shù)脊髓性肌肉萎縮癥患者運動神經(jīng)SMN1基因缺失〔22〕。

2 蛋白質組學方法的概述

質譜法(MS)蛋白質組學的發(fā)展對多肽或蛋白質成分復雜的混合物的檢測提供了有效幫助，使檢測實驗中蛋白質的靈敏度、準確度和速度有所提升〔23〕。MS還可以應用于不同樣本之間的定性和定量的蛋白質差異的比較，尤其是發(fā)病組與未發(fā)病組。結合各種各樣的蛋白質組學方法不僅可以分析蛋白質的特征，而且還可以分析細胞和生化通路，可以為神經(jīng)退行性疾病生物學標志的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)做出貢獻。

功能蛋白質組學是專門收集蛋白質表達、轉錄后修飾(PTMs)和活動信息的研究方法，不僅僅是蛋白質鑒定，并且可以使我們對生物系統(tǒng)的功能有更全面的理解。功能蛋白質組學可以運用數(shù)學模型或其他生物學工具進行系統(tǒng)的生物化學分析〔24〕。隨著MS技術的提升，可以結合MS與蛋白質微陣列技術來評估蛋白質之間的相互作用〔25〕。激酶組學是功能蛋白質組學的一個分支，主要涉及激酶的識別〔26〕，還可以識別激酶靶蛋白質，并闡明細胞通路〔27〕。

化學蛋白質組學是集生物化學、細胞生物學、有機合成和質譜于一體的學科〔28〕。這種方法為識別疾病潛在的生物學標記和藥物靶點提供了機會。臨床蛋白質組學，或稱為平移蛋白質組學的目的是幫助疾病早期診斷、預測疾病進展、識別新的治療靶點及評估治療療效〔29〕。氧化還原蛋白質組學是蛋白質組學的一個不斷發(fā)展的分支，目的是識別和量化在病理條件下氧化的蛋白質，更好的理解蛋白質氧化〔30〕。不同的蛋白質組學方法適用于不同的神經(jīng)退行性疾病。

3 蛋白質組學技術對神經(jīng)退行性疾病的研究

3.1樣品制備 蛋白質樣品可以應用于各種目的，如下游識別、量化、功能研究。組織破壞有機械破壞或酶消化，組織破壞后，細胞已經(jīng)溶解，即可提取蛋白質〔31〕。提取蛋白質的方法必須考慮到處理材料的數(shù)量和要使用的分析方法(電泳，色譜法，質譜法)。生物液體樣品制備往往需要在質譜分析之前去除干擾成分及分餾。

3.2蛋白質分離 蛋白質分離方法基于電泳或色譜法。疾病的蛋白質表達，二維凝膠電泳(2-DE)與MS結合最常用〔32〕。在2-DE中，蛋白質混合物根據(jù)等電點(PI)在第一維度分離，根據(jù)分子量在第二維度分離，并使用多種可視化蛋白質染色方法。比較兩個蛋白樣品，由于蛋白質樣品被不同熒光劑示蹤，凝膠電泳(DIGE)的結果具有差異性〔33〕。由于各蛋白樣本有不同的蛋白表達，被不同標記物標記的不同蛋白質混合物，可在同一張2-DE凝膠上進行蛋白質分離。除了電泳技術，各種依靠液相色譜法(LC)的無凝膠方法也可用于蛋白質或多肽的分離。LC在比較蛋白質組學中是可以從復雜混合物中分離出完整的蛋白質的重要方法〔34〕。多維蛋白質識別技術(MudPIT)是LC的重要擴展，由于不同固定相的分配系數(shù)不同可分離高度復雜的蛋白質混合物〔35〕。色譜質譜聯(lián)用技術可以用于蛋白質自動識別、翻譯后修飾(PTM)特性和蛋白質的量化。表面增強激光解吸/電離質譜技術(SELDI-MS)源自基質輔助激光解吸電離質譜技術(MALDI-MS)，結合色譜法固相萃取及飛行時間質譜法(TOF-MS)檢測蛋白質，可發(fā)現(xiàn)有診斷價值的特異蛋白質〔36〕。

3.3蛋白質識別和量化 由于高靈敏度和高選擇性，蛋白質鑒定首選MS。質譜儀可分離和檢測氣相離子，因此必須使用不同的電離技術電離和蒸發(fā)分析物。常見的電離技術是電噴霧電離(ESI)和基質輔助激光解吸電離(MALDI)〔37〕。質量分析器利用電氣或磁場將生成的氣相離子分離。蛋白質鑒定中，首先利用肽鏈內切酶或胰蛋白酶消化蛋白質或蛋白質混合物，利用MS檢測蛋白質消化產(chǎn)生的肽段，將得出來的實驗序列與基因組序列數(shù)據(jù)庫對應蛋白質理論序列對比。在蛋白質組學研究中需要測量某個生物樣本中的相對或絕對質量。同位素標記定量法用于蛋白質的量化檢測。細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記(SILAC)是基于MS的利用非放射性同位素檢測樣本中的蛋白質差異的技術。無標記定量方法是使用三級四極串聯(lián)質譜的多反應監(jiān)測(MRM)技術。這些方法將對疾病的發(fā)病機制及臨床診斷提供有力的幫助。

4 蛋白質組學在神經(jīng)退行性疾病中的應用

蛋白質幾乎參與所有生物過程，可以作為疾病的有效的生物學標志。由于神經(jīng)退行性疾病患者的腦組織很難得到，血液及腦脊液(CSF)較容易獲得，多數(shù)時候利用神經(jīng)退行性疾病患者體液進行相關研究。如Keeney等〔38〕使用氧化還原蛋白質組學確定各種神經(jīng)退行性疾病包括AD和PD患者血清和CSF 中氧化的蛋白質。結果顯示在AD和PD中載脂蛋白(Apo)A-1水平降低，ApoA-1受影響高度氧化變性形成4-羥-2-壬烯(HNE)，ApoA-1氧化可直接導致神經(jīng)退化，ApoA-1可以作為有效的診斷標記物及藥物治療靶點。

4.1AD 最近LC-電噴霧離子化(ESI)-MS用來研究無癥狀和癥狀性家族性AD和晚發(fā)性AD CSF中PSEN1和APP蛋白表達的差異〔39〕。雖然56個蛋白表達有差異(46個表達上調和10個表達下調)，所有AD組CSF中各蛋白表達明顯重疊。除了已經(jīng)確定的AD相關蛋白，研究還發(fā)現(xiàn)許多獨特的蛋白質包括calsyntenin-3、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPA)、4谷氨酸受體、CD99抗原、CTBS及磷分泌蛋白質1。Albertini等〔40〕最近使用SELDI-TOF-MS技術發(fā)現(xiàn)AD CSF 的 Aβ肽亞型。通過免疫蛋白組學發(fā)現(xiàn)散發(fā)的AD相比精神分裂癥患者的CSF所有肽亞型均減少，15個不同Aβ肽亞型中Aβ1～42是唯一減少的，可以作為AD的生物學標志。Wijte等〔41〕應用樣品制備方法對AD患者CSF行多肽分析，發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)生的內源性肽和多肽共價結合蛋白。VGF神經(jīng)生長因子誘導蛋白和補體C4存在于自由肽部分，蛋白結合部分存在VGF神經(jīng)生長因子誘導蛋白和α2-HS型糖蛋白〔42〕。為了評估多肽分析對早期AD的診斷，Jahn等〔42〕開發(fā)了一種新技術應用毛細管電泳質譜法識別AD的生物學標志，檢測到CSF中1 104種低分子量肽存在。

4.2PD 為了更好地在分子和細胞水平了解PD的發(fā)病機制及診斷生物標志物，若干研究利用血液(全血、血漿、血清)和CSF行蛋白質組學分析。Zhao等〔43〕利用2-DE結合MS技術分析了中國PD組的血清蛋白質變化，15種蛋白質被檢測出來，其中7種是PD的特異性蛋白質。分析表明，這些蛋白質很可能參與抗氧化作用、脂質代謝、細胞內轉運、細胞增殖和免疫調節(jié)。Chen等〔44〕利用2-DE-MS技術對非PD組和PD組血漿行蛋白質組學分析。結果顯示IgGκL和人類血清淀粉樣蛋白(SA)P具有表達差異性，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測出PD血漿中SAP濃度比非PD組顯著提高，提示SAP可作為PD的生物學標志。

對PD組和對照組利用2-DE技術行CSF蛋白質組學差異分析，血清白蛋白、血紅蛋白β片段、突變球蛋白、富含脯氨酸蛋白(PRR)14和血清轉鐵蛋白N端具有差異表達，這些蛋白可能導致神經(jīng)功能障礙及PD的發(fā)病及進展〔45〕。無油凝膠蛋白質組學方法被用來識別和量化CSF中蛋白質和多肽。Zhang等〔46〕利用iTRAQ技術結合2D LC-MS/MS分析PD不同階段的差異蛋白質組，結果顯示26個不同的蛋白質，8個上調蛋白，18個下調蛋白質，這些蛋白質可能與氧化應激、線粒體功能障礙，蛋白質異常聚合和炎癥有關。

由于某些蛋白存在于PD中，一些研究采用血液和CSF行蛋白質組學分析。如DJ-1蛋白質存在于常染色體隱性遺傳PD及特發(fā)性PD中，已經(jīng)被證實是人類CSF中的生物標志物〔47〕，且具有抗氧化和相關的神經(jīng)保護作用〔48〕。早期的PD組和對照組之間的對照研究顯示在PD組CSF中DJ-1水平降低，但在血漿中無顯著差異〔49〕。Lin等〔50〕利用另外的114例樣本進行了驗證，建議把全血中的DJ-1亞型而不是總的DJ-1作為遲發(fā)型PD的生物學標志。

為了分析PD的生物學標志，可以應用先進的生物信息學和生物統(tǒng)計學軟件包括Biomarker Wizard 3.1，Biomarker Patterns Software，Ciphergen 3.1 Biomarker Wizard與MS結合。這些軟件通過定義識別模式和分類樹來分類蛋白質。他們通過聚類分析自動檢測質量峰值，使用適當?shù)慕y(tǒng)計方法來計算峰值的靈敏度和特異性。靈敏度是區(qū)分出總疾病病例中準確分類疾病病例的能力，而特異性區(qū)分出對照病例總數(shù)中準確分類對照病例的能力。

4.3HD 關于HD生物液體中的生物學標志蛋白質組學研究并不多。Dalrymple等〔51〕嘗試應用2-DE和MALDI-TOF 技術對HD組及對照組的血漿和CSF進行蛋白質組學分析，得出叢生蛋白是HD確定的生物學標志。Huang等〔52〕發(fā)現(xiàn)HD患者CSF中凝血酶原水平、ApoA-Ⅳ和結合珠蛋白表達升高，可以確定它們參與HD的發(fā)病機制，可作為HD的診斷生物學標記。

4.4ALS 基于蛋白質組學技術很少有ALS的生物學標志的發(fā)現(xiàn)。Ranganathan等〔53〕應用SELDI-TOF-MS和Subsequent biomarker wizard技術發(fā)現(xiàn)ALS CSF中甲狀腺素運載蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制物C水平降低，神經(jīng)內分泌蛋白7B2水平升高。Pasinetti等〔54〕使用類似的蛋白質組學方法，在ALS 患者CSF中驗證了半胱氨酸蛋白酶抑制物C水平降低，并且發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)內分泌蛋白質VGF消化型片段的存在。最近應用2D-DIGE技術分別快速和緩慢進展的ALS患者和對照組的CSF行蛋白質組學研究，在快速進展型ALS的CSF中發(fā)現(xiàn)了6種上調蛋白質。除此之外，胎球蛋白A和甲狀腺素運載蛋白也被證實可作為ALS的生物學標志〔55〕。

4.5其他神經(jīng)退行性疾病 Constantinescu等〔56,57〕應用SELDI-TOF-MS技術對56例PD患者的CSF和非典型帕金森疾病患者(ADP)的CSF:包括42例帕金森疊加綜合征(MSA)患者，39例進行性核上性麻痹(PSP)患者，9例皮質基底核變性(CBD)者和24例正常人的CSF進行蛋白質組學分析。泛素、β2微球蛋白和兩種分泌粒蛋白1(嗜鉻粒蛋白B)碎片在正常人和PD患者有差異性，但PD組和各APD對照組無明顯差異性。

5 蛋白質組學對于神經(jīng)退行性疾病的臨床意義

神經(jīng)退行性疾病是一類癥狀表現(xiàn)和疾病進展有明顯異質性的疾病，甚至在相同的神經(jīng)退行性疾病不同的疾病表型癥狀表現(xiàn)各異。由于生物學的異質性需要了解疾病的發(fā)病機制，預后標志物的識別比診斷標記物的識別來得容易，并且將對藥物治療改變疾病的進展產(chǎn)生巨大影響。預后標記物能夠對高?；颊哌M行早期預防，使得藥物開發(fā)效率更高，成本更低。

綜上，蛋白質組學與神經(jīng)影像、臨床數(shù)據(jù)的結合可以提高神經(jīng)退行性疾病診斷的準確性，增強生物標志物的驗證能力。蛋白質組學研究本身還存在許多缺點和不足，隨著現(xiàn)代生物技術和信息技術發(fā)展，蛋白質組學研究將為病理機制、建立診斷標準、發(fā)現(xiàn)藥物治療靶點等方面做出更大的貢獻。

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57Marras C,Lang A.Parkinson's disease subtypes:lost in translation〔J〕? J Neurol Neurosurg Psychiatry,2013;84(4):409-15.

〔2016-08-19修回〕

(編輯 李相軍)

R741

A

1005-9202(2017)19-4914-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.102

國家自然科學基金資助項目(30560042,81160161,81360198)

徐仁伵(1969-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事肌萎縮側索硬化和帕金森病的發(fā)病機制和防治研究。

朱 蕾(1989-)，女，博士，主要從事肌萎縮側索硬化的防治研究。