李 勇， 楊 特，沈 怡

(重慶市中醫(yī)院心血管內科 400011)

miRNA-26a抑制ox-LDL介導的HAECs凋亡作用的機制研究

李 勇， 楊 特，沈 怡

(重慶市中醫(yī)院心血管內科 400011)

目的 探究miR-26a在ox-LDL介導內皮細胞HAECs凋亡中的作用及其調控機制。方法 采用不同濃度的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)在體外作用于HAECs細胞，噻唑藍(MTT)和TUNEL染色檢測ox-LDL作用HAECs后細胞的活性與凋亡率，定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測ox-LDL作用HAECs后細胞中miR-26a的表達水平。在HAECs中過表達miR-26amimic,MTT和TUNEL染色檢測ox-LDL作用后細胞的活性和凋亡率。構建熒光素酶報告載體pMIR-PTEN的3′UTR，利用熒光素酶活性檢測鑒定miR-26a的預測靶基因。qRT-PCR和蛋白質印跡法(Westernblot)分別檢測PTEN的mRNA和蛋白表達水平。結果ox-LDL能夠介導HAECs細胞的毒性死亡和細胞凋亡，并且降低了HAECs細胞中miR-26a的表達水平。過表達miR-26amimic能夠抑制ox-LDL作用HAECs后細胞的毒性和凋亡。轉染miR-26amimic顯著抑制熒光素酶的活性(P<0.05)。轉染miR-26amimic顯著下調HAECs細胞中PTEN的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)。結論miR-26a能夠抑制抑制ox-LDL作用HAECs后細胞的毒性和凋亡，其可能的作用機制是下調了PTEN的表達。miR-26a可能成為治療凋亡相關的動脈粥樣硬化的潛在靶點。

微RNAs;人類主動脈內皮細胞;第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因；細胞凋亡；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是引起死亡和殘疾的主要原因之一[1]。內皮細胞的凋亡被認為是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的一個關鍵進程。由于內皮細胞的凋亡，內皮組織將失去調控脂質穩(wěn)態(tài)，免疫及炎癥的能力。內皮細胞的損傷打破了內皮組織完整的屏障功能，利于脂質體的沉積，而導致動脈粥樣硬化的發(fā)生[2-4]。此外，內皮細胞的凋亡也會引起斑塊的不穩(wěn)定，而引起急性心肌梗死和猝死。然而現(xiàn)階段內皮細胞的凋亡機制研究還并不清楚。

MicroRNAs(miRs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類長度較短的非編碼RNA分子，長度約為22個核苷酸，與靶mRNAs或靶mRNAs的3′非翻譯區(qū)互補結合，誘導靶mRNAs降解或抑制靶mRNAs的翻譯，從而實現(xiàn)轉錄后基因的表達調控作用[5-6]。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a在多種心血管疾病中表達是失調的，其中包括心臟肥大、心房纖維性顫動和心肌缺血[7]。芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-26a的表達在主動脈瓣狹窄患者的主動脈瓣中下調了65%，而具體的分子生物學機制尚未闡明[8]。

本研究旨在探究miR-26a在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)介導內皮細胞HAECs凋亡中的作用機制。明確miR-26a在內皮細胞凋亡中與PTEN表達的調控關系及其在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1．1 細胞株 人類主動脈內皮細胞系HAECs及轉染用工具細胞HEK293均購自上海細胞研究所。

1.1.2 試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國hyclone公司)，反轉錄試劑盒(日本Taraka公司)，RNA 提取試劑Trizol，LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen 公司)，miR-26a 逆轉錄引物(廣州銳博公司),ox-LDL(上海生工)，細胞活性測定試劑噻唑藍(MTT，上海碧云天公司)， TUENL凋亡檢測試劑(美國Roche公司)。野生型PTEN的3′UTR及突變型PTEN的 3′UTR寡核苷酸(上海英駿公司)。PTEN、GAPDH一抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人類主動脈內皮細胞系HAECs和HEK293細胞用含10%胎牛血清的DMEM/H培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 按照TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit說明書加入逆轉錄反應所需試劑，miR-26a逆轉錄引物，總RNA進行逆轉錄反應。反轉錄條件：42 ℃15 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA作為模板進行qRT-PCR擴增，根據(jù)Premix ExTaq試劑盒說明加入Premix、miR-26a正向引物和miR-26a反向引物進行反應。qRT-PCR條件：95 ℃ 1 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s，共行39次循環(huán)；反應結束后得到Ct值，根據(jù)Ct值進行相對定量分析。

1.2.3 MTT測定細胞活性 取對數(shù)期的HAECs細胞接種于96孔板中，接種密度為1×105/mL，加入不同濃度的(0、1、10、25、50 μg/mL)ox-LDL處理后，共培養(yǎng)24 h，后去掉上清，加入含有10%MTT的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后加入DMSO溶解所形成的甲瓚晶體，在570 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)對應的吸光度值，計算細胞的相對活性。在過表達miR-26a抑制了ox-LDL對HAECs細胞活性能力MTT測定中共分為4組：Control組、ox-LDL組、ox-LDL+miR-26a mimic組、ox-LDL+miR-NC組，各組培養(yǎng)24 h后，處理方法同前。

1.2.4 TUNEL法檢測細胞的凋亡 6孔板中處理作用后的HAECs細胞，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1 次，加4%多聚甲醛固定1 h，PBS 洗滌1 次，加入含0.1%Triton X-100 的PBS 冰浴2 min，室溫下在含0.3%過氧化氫的甲醇溶液中孵育20 min，PBS 洗滌3 次，加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗滌3次后用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下拍照并計數(shù)。在過表達miR-26a抑制了ox-LDL對HAECs細胞凋亡測定中共分為4組：Control組、ox-LDL組、ox-LDL+miR-26a mimics組、ox-LDL+miR-NC組，各組培養(yǎng)24 h后，處理方法同前。

1.2.5 pMIR-PTEN的3′UTR熒光報告載體構建及熒光素酶活性檢測 合成野生型PTEN的 3′UTR及突變型PTEN的 3′UTR寡核苷酸經(jīng)退火，雙酶切后插入熒光素酶報告基因載體pMIR-REPORT，在含有miR-26a結合位點的PTEN的3′UTR片段，構建pMIR-PTEN的 3′UTR載體。HEK293細胞接種于96孔板，24 h后細胞貼壁達70%時進行轉染。轉染分為4組，分別是miR-NC和pMIR-PTEN的 3′UTR 組，miR-26a mimic和pMIR-PTEN的 3′UTR轉染組，miR-NC和突變型pMIR-PTEN的3′UTR組，miR-26a和突變型pMIR-PTEN的3′UTR組，再與質粒pRL-TK共轉染HEK293細胞。轉染24 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)處理裂解細胞， GloMax20/20 Luminometer檢測熒光強度。

1.2.6 蛋白質印跡法(Western blot) 將轉染miR-26a mimics和miR-NC后的兩組HAECs細胞使用細胞裂解緩沖液裂解，12 000 r/min離心15 min，收集上清并行蛋白濃度測定。取20 μg蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE膠分離后，濕轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別采用PTEN的一抗(1∶1 000稀釋)， GAPDH的一抗(1∶ 2 000稀釋)孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG孵育1 h，采用Supersignal West Dura Extended Duration Substrate 試劑處理并曝光顯色。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用非配對t檢驗分析組間差異。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ox-LDL對HAECs細胞活性、凋亡及miR-26a的影響 結果表明，ox-LDL的10、25、50 μg/mL濃度能夠顯著抑制HAECs細胞的活性(圖1A)，顯著促進HAECs細胞的凋亡發(fā)生(圖1B)，顯著抑制HAECs細胞中miR-26a的表達水平(圖1C)。

2.2 過表達miR-26a抑制ox-LDL對HAECs細胞活性和凋亡的作用 體外轉染實驗表明，轉染miR-26a 模擬物顯著提高了miR-26a在HAECs細胞中的表達水平(圖2A)。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，轉染miR-26a mimics組較轉染miR-NC組顯著增強了ox-LDL作用HAECs細胞后的活性(圖2B)。TUNEL凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，轉染miR-26a mimics組較轉染miR-NC組顯著抑制了ox-LDL作用HAECs細胞后的凋亡發(fā)生(圖2C)。

A:MTT檢測不同濃度ox-LDL作用HAECs后的細胞活性；B:TUNEL檢測不同濃度ox-LDL作用HAECs后的細胞的凋亡率；C:qRT-PCR檢測不同濃度ox-LDL作用HAECs后的細胞中miR-26a的相對表達水平；a：P<0.05,與0 μg/mL ox-LDL比較。

圖1 ox-LDL對HAECs細胞活性、凋亡及miR-26a的影響

A:轉染miR-26a mimic后HAECs細胞中miR-26a的相對表達水平；B:不同處理組作用HAECs后的細胞活性；C:不同處理組作用HAECs后的細胞凋亡率；a：P<0.05,與轉染miR-NC組比較。

圖2 過表達miR-26a抑制ox-LDL對HAECs細胞活性和凋亡的作用

2.3 pMIR-PTEN的 3′UTR熒光報告載體構建及熒光素酶活性檢測 采用生物信息學軟件(Targetscan)預測miR-26a的靶基因PTEN，同時構建PTEN3′UTR及突變型3′UTR的熒光素酶報告基因載體(圖3A)。熒光素酶活性檢測結果顯示，轉染miR-26a mimics和pMIR-PTEN的 3′UTR的熒光強度較轉染miR-NC和pMIR-PTEN的 3′UTR顯著降低(P<0.05)，miR-26a對pMIR-PTEN的 3′UTR的表達具有抑制作用，并且該抑制功能通過miR-26a與pMIR-PTEN的 3′UTR區(qū)結合實現(xiàn)，提示PTEN是miR-26a的靶基因(圖3B)。

A:Targetscan預測miR-26a的靶基因；B：檢測不同轉染組的相對熒光素酶活性。

圖3 pMIR-PTEN的 3′UTR熒光報告載體構建及熒光素酶活性檢測

2.4 PTEN的mRNA和蛋白表達水平 轉染miR-26a mimics后PTEN mRNA和蛋白水平較轉染miR-NC顯著降低。見圖4。

A:qRT-PCR檢測轉染miR-26a mimic后HAECs細胞中PTEN的相對表達水平;B：Western blot檢測轉染miR-26a mimic后HAECs細胞中PTEN的蛋白表達水平。

圖4 PTEN的mRNA和蛋白表達水平

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種復雜的免疫炎性疾病。內皮細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮重要的作用。重要的是血管內皮細胞的損傷通常被認為是動脈粥樣硬化發(fā)生的起始步驟。促動脈粥樣硬化的危險因素包括，高血糖、血管緊張素Ⅱ、ox-LDL，這些因素均能介導內皮細胞的凋亡[9]。ox-LDL在損傷形成，刺激內皮細胞的自殺性程序死亡發(fā)揮關鍵的作用，其主要的機制是通過caspase依賴和caspase非依賴的途徑介導的。miRNAs的異常表達參與調控了多種內皮細胞的存活與死亡，新近的研究報道了miR-126影響了內皮細胞的重建，同時也有研究表明miR-21、miR-223、miR-29b等參與了內皮細胞的凋亡[10]。miR-26被報道在心血管疾病中發(fā)揮不同的功能，miR-26a的過表達能夠減少房顫的發(fā)生率[11],另外miR-26a能夠發(fā)揮抗血管生成因子的作用，miR-26a在內皮細胞中表達的降低能夠促進血管的生成。本研究發(fā)現(xiàn)了miR-26a在內皮細胞發(fā)揮著抗細胞凋亡的重要作用。

PTEN起初被鑒定發(fā)揮腫瘤抑制子的功能，主要通過PI3K依賴的信號通路[12]。凋亡是細胞的一種程序性死亡，而在這個過程中線粒體和內質網(wǎng)都發(fā)揮了重要的作用。有文獻報道，用凋亡誘導劑staurosporine處理細胞后，能夠使PTEN定位聚集于線粒體[13]。更進一步的研究表明抑制PTEN的表達能夠顯著降低活性氧族(ROS)的增加水平，同時也有研究表明PTEN的沉默表達損傷了雌激素受體(ER)鈣離子的釋放功能，這就降低了細胞質和線粒體中鈣離子的濃度，也就降低了細胞對鈣離子介導的凋亡刺激信號的敏感性[14]。這些研究均表明了PTEN在促凋亡發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。

在本研究中，證實了miR-26a是體外內皮細胞凋亡過程中的關鍵因子。miR-26a的過表達能夠抑制逆轉ox-LDL介導的HAECs凋亡作用。其主要的作用機制是miR-26a抑制了其靶向調控基因PTEN及PTEN相關的凋亡信號通路。本研究為血管性疾病(如動脈粥樣硬化)的治療提供了新的治療靶點和研究策略。

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Study on the mechanism of miRNA-26a inhibiting ox-LDL-mediated apoptosis of HAECs

LiYong，YangTe,ShenYi

(DepartmentofCardiovascularMedicine,ChongqingTraditionalChineseMedicineHospital,Chongqing400011,China)

Objective To investigate the role of miR-26a in ox-LDL-mediated apoptosis of HAECs in endothelial cells and its mechanism.Methods Various concentrations of ox-LDL were added in HAECs culture.Cell cytotoxicity and apoptosis were monitored by MTT and TUNEL assay,and expression level of miR-26a examined by qRT-PCR.Overexpression of miR-26a mimic in HAECs,MTT and TUNEL staining were used to detect the activity and apoptosis of ox-LDL.The 3′UTR of luciferase reporter vector pMIR-PTEN was constructed and the predicted target gene of miR-26a was identified by luciferase activity assay.QRT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of PTEN.Results ox-LDL could mediate the toxic death and apoptosis of HAECs cells,and decrease the expression level of miR-26a in HAECs cells.Overexpression of miR-26a mimic could inhibit the cytotoxicity and apoptosis of ox-LDL cells after HAECs.Transfection of miR-26a mimics significantly inhibited luciferase activity (P<0.05).The expression of mRNA and protein in HAECs cells was significantly down regulated by transfection of miR-26a analog (P<0.05).Conclusion MiR-26a can inhibit the cytotoxicity and apoptosis of ox-LDL cells after HAECs inhibition,and the possible mechanism of action is to down regulate the expression of PTEN.The study suggests that miR-26a may be a potential target for the treatment of atherosclerosis related to apoptosis.

microRNAs;HAECs;PTEN;apoptosis;atherosclerosis

李勇(1972-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事冠心病基礎與臨床研究。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.004

R

A

1671-8348(2016)36-5052-04

2016-08-11

2016-10-06)