潘 喆,張 輝,宋文靜

(天津市南開區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300102)

HPLC法測定清熱膠囊中連翹苷的含量

潘 喆,張 輝*,宋文靜

(天津市南開區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300102)

目的：建立HPLC法測定清熱膠囊中連翹苷含量。方法：取清熱膠囊樣品經(jīng)中性氧化鋁柱預(yù)處理，再以Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)為色譜柱，乙腈-水(25∶75)為流動相，檢測波長為277 nm，流速為1.0 ml/min。 結(jié)果：連翹苷含量與峰面積在0.216 0～2.16 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)；平均回收率為99.7%，RSD為1.18%(n=9)。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于清熱膠囊中連翹苷的含量測定。

連翹苷，HPLC，清熱膠囊，含量測定

清熱膠囊是天津市南開區(qū)中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，主要含有連翹、大青葉、拳參、板藍(lán)根等中藥，具有清熱解毒、透熱達(dá)表、利咽消腫的功效，適用于外感風(fēng)熱、咽喉腫痛、口干咽燥、久熱不退者。目前該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了拳參和連翹的薄層鑒別，沒有定量檢測方法。連翹苷作為清熱膠囊中主要有效成分之一，本課題擬采用HPLC法測定其含量，建立一種準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)、簡便快捷的定量方法，從而進(jìn)一步提升該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

美國戴安UltiMate TM3000高效液相色譜儀(檢測器：VWD-3100；泵：ISO-3100SD；自動進(jìn)樣器：WPS-300SL)；KH3200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。連翹苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110821-200111)；清熱膠囊由本院制劑室提供(批號130909、131208、140110)。甲醇、乙腈為色譜純；娃哈哈純凈水(批號201307253221TJ，天津娃哈哈食品有限公司)；其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-水(25∶75)；檢測波長：277 nm；柱溫：20 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；理論塔板：按照連翹苷峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取干燥至恒重的連翹苷對照品約5 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加70%乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻即得濃度為0.216 0 mg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取清熱膠囊內(nèi)容物約3.0 g，精密稱定后置于錐形瓶中，精密加甲醇15 ml，再稱定重量，然后放置過夜，超聲處理30 min，放冷，再次稱重，并用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻后過濾，立即精密量取濾液5 ml，蒸至近干，加中性氧化鋁1.5 g到中性氧化鋁柱(100～120目，1 g，內(nèi)徑為1～1.5 cm)中，用70%乙醇80 ml洗脫后收集洗脫液，再濃縮至干，殘渣用50%甲醇溶解轉(zhuǎn)移，至5 ml量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液，即得供試品溶液[1]。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取缺少連翹的陰性樣品，依照供試品溶液的同法進(jìn)行操作制備。連翹苷對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液的HPLC色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考查 精密稱取連翹苷對照品儲備液制成濃度為0.216、0.432、0.864、1.728和2.16 μg/ml的溶液。依次注入高效液相色譜儀，并記錄得到的色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣量 (μg) 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=0.034 4X-0.023 5(r=0.999 7)，連翹苷的進(jìn)樣量在0.216 0～2.16 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗 取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次測定，根據(jù)所得峰面積值計算，RSD為0.496%，儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號樣品(140110)6份，按上述方法分別測定其含量，測得樣品中連翹苷平均含量為0.698 5 mg/粒，RSD為1.53%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 將清熱膠囊(140110)按供試品溶液制備項下方法制備供試品溶液后立即進(jìn)樣，然后每隔2 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣4次，最后隔1 d進(jìn)樣1次。RSD為1.79%。結(jié)果表明，連翹苷峰面積值在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品9份(批號140110，含量：2.328 3 mg/g)，精密稱定，分別精密加入連翹苷對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法操作，按“2.1”項下色譜條件分別測定。結(jié)果平均回收率為99.7%，RSD值為1.18%。見表1。

1.連翹苷

編號樣品中含量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)13．48590．25923．741298．523．48620．25923．7484101．233．49590．25923．752499．043．48850．32403．8155100．953．48780．32403．809699．363．49040．32403．809598．573．49780．38883．8926101．583．49200．38883．877499．193．48990．38883．876199．3

2.8 樣品含量測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10 μl，依照上述色譜條件測定， 3批樣品中連翹苷的含量測定結(jié)果見表2。

表2 連翹苷含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動相的考查 為了達(dá)到較好的分離效果，參照《中國藥典》和其他文獻(xiàn)資料[2-10]，分別以乙腈-水(25∶75)和乙腈-0.5%磷酸溶液(25∶75)作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者對結(jié)果影響相差不大，均能使連翹苷得到較好的分離，峰形較好，拖尾較輕，可以作為分離清熱膠囊中連翹苷的流動相，故本研究選用前者。

3.2 提取方式的考查 通過比較，超聲提取和回流提取測得的含量相近，但由于超聲提取簡便，因此本實驗采用超聲提取這種方式。

3.3 超聲時間的考查 在提取時間上分別以15、30和60 min作比較分析。結(jié)果表明，超聲15 min的提取率較低，而超聲處理30和60 min無明顯區(qū)別，故選用提取時間30 min。

3.4 含量測定的結(jié)果 本實驗以連翹苷為對照品，參考《中國藥典》的方法制定本院院內(nèi)制劑清熱膠囊的含量測定方法，本法易于操作，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，提高了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可用于本品的質(zhì)量控制。

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2 李文春，孫永慧，解黎雯，等．HPLC同時測定雙黃連粉針劑中15種成分的含量[J]．中國新藥雜志，2014，23(22):2614-2618

3 宋小俊，雷立，李惠民，等．商洛不同產(chǎn)地青翹和老翹中連翹苷及連翹酯苷A含量研究[J]．吉林中醫(yī)藥，2014，34(12):1289-1291

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5 陳建琴．UPLC雙波長切換法測定銀黃連口服液中綠原酸、黃芩苷、連翹苷的含量[J]．中國藥師，2014，17(12):2010-2012

6 劉利輝，徐劍，張永萍．UPLC測定銀翹散中的多指標(biāo)性成分[J]．中國實驗方劑學(xué)，2014，20(24):67-70

7 劉紅娜，張小華，龐偉．小兒解表顆粒中連翹苷含量測定[J]．食品與藥品，2014，16(6):441-443

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2016-01-11

張輝，E-mail：zh307@sina.com。

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