張 囡，陳雙璐，林 宏

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

HPLC法測(cè)定疏表靈顆粒中芍藥苷和白花前胡甲素含量

張 囡，陳雙璐，林 宏*

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

目的：建立HPLC法測(cè)定疏表靈顆粒中芍藥苷和白花前胡甲素含量。方法：色譜柱為Shim-pack VP-ODS(150 mm ×4.6 mm)，流動(dòng)相為乙腈-0.4 %磷酸水溶液梯度洗脫，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，進(jìn)樣量10 μl。結(jié)果：芍藥苷和白花前胡甲素分別在16.8～336.0 μg/ml和2.0～40.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，芍藥苷的平均加樣回收率為100.09%，RSD為1.00%(n=9)，白花前胡甲素的平均加樣回收率為100.08%，RSD為1.22%(n=9)。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于疏表靈顆粒的質(zhì)量控制。

疏表靈顆粒，芍藥苷，白花前胡甲素，HPLC

疏表靈顆粒為本院常用醫(yī)院制劑(批準(zhǔn)文號(hào)：津藥制字Z20070313)，由前胡、赤芍、板藍(lán)根、玄參、天花粉、淡豆豉等18味中藥制成，具有散風(fēng)解表、解肌透疹、清熱解毒的功效，主要用于小兒呼吸道感染、流感、麻疹、風(fēng)疹、幼兒急疹。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，為提高其標(biāo)準(zhǔn)，有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定本品中芍藥苷和白花前胡甲素含量，以此作為該制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津)，LC solution色譜工作站；電子天平(梅特勒-托利多AL-104)。

1.2 試藥 芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110736-201438)，白花前胡甲素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110766-200619)；疏表靈顆粒(天津市兒童醫(yī)院，批號(hào)20150401、20150501、20150601)；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：0.4%磷酸-乙腈梯度洗脫，如表1；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm[1]；柱溫20 ℃；流速1 ml/min；進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按芍藥苷和白花前胡甲素峰計(jì)算均不低于2 000。

表1 疏表靈顆粒梯度洗脫時(shí)間表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取芍藥苷、白花前胡甲素對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成濃度為1.52 mg/ml的芍藥苷及濃度為0.40 mg/ml的白花前胡甲素對(duì)照品貯備液。精密量取兩種貯備液各1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液[2-4]。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異下的疏表靈顆粒，研細(xì)，精密稱定約2.0 g，置25 ml量瓶中，加入甲醇適量，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得[5-8]。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方配比，制備不含赤芍、前胡的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考查 分別精密量取0.76 mg/ml 的芍藥苷對(duì)照品溶液和濃度為0.40 mg/ml白花前胡甲素對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.5、5.0、7.5和10.0 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：芍藥苷為A=12 145.93C-32 892.27 (r=0.999 9，n=6)；白花前胡甲素為A=12 576.87C+11 448.78 (r=0.999 8，n=6)。結(jié)果表明：芍藥苷在16.8～336.0 μg/ml范圍內(nèi)、白花前胡甲素在2.0～40.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.芍藥苷 2.白花前胡甲素

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(20150401)顆粒適量，精密稱取2.0 g，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算出芍藥苷含量為982.5 μg/g，白花前胡甲素含量為240.0 μg/g，計(jì)算RSD分別為0.45%和0.99%。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算芍藥苷和白花前胡甲素峰面積的RSD分別為0.84%及0.66%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(20150401)顆粒適量，精密稱取2.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0、2、4、6、8、12和24 h進(jìn)樣，測(cè)得芍藥苷和白花前胡甲素峰面積值的RSD分別為0.50%及0.86%，符合要求。

2.7 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知含量的同一批號(hào)(20150501)樣品適量，精密稱取2.0 g，9份，按樣品含量的80%、100%和120%加入適量芍藥苷和白花前胡甲素對(duì)照品，按 “2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD。測(cè)得樣品中芍藥苷平均回收率為100.09%，RSD為1.00%；白花前胡甲素平均回收率為100.08%，RSD為1.22%。結(jié)果見表2和表3。

表2 芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表3 白花前胡甲素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.8 樣品測(cè)定 取疏表靈顆粒樣品3批(批號(hào) 20150401、20150501、20150601)，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定樣品中芍藥苷和白花前胡甲素的含量。結(jié)果樣品中芍藥苷的含量分別為953.7、950.3和947.9 μg/g，白花前胡甲素的含量分別為253.8、249.8和248.3 μg/g。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇 疏表靈顆粒方中赤芍、前胡為主藥，芍藥苷是赤芍中主要的有效成分，藥理實(shí)驗(yàn)表明芍藥苷具有抗氧化、降低血液黏度、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)及擴(kuò)張血管等作用；且芍藥苷能抑制腫瘤細(xì)胞膜上ATP活性及升高腺苷酸，環(huán)化酶活性的作用[9]。白花前胡甲素為前胡中提取出的一種角型吡喃香豆素，為前胡中主要活性成分，具有舒張氣管平滑肌、抑制血小板聚集、促鉀通道開放、阻滯鈣內(nèi)流、抗缺血再灌注損傷等作用[10]。因此選擇對(duì)芍藥苷和白花前胡甲素進(jìn)行含量測(cè)定，可以有效控制赤芍、前胡的質(zhì)量，進(jìn)而控制疏表靈顆粒的質(zhì)量。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的考查 分別對(duì)芍藥苷與白花前胡甲素進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，可得知二者最大吸收波長(zhǎng)分別為230 nm及322 nm。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，如設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，白花前胡甲素吸收值較低，且峰形較差。而檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為320 nm，芍藥苷吸收度較好，故選用320 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法的考查 本研究在實(shí)驗(yàn)過程中分別采用不同比例的甲醇、乙醇、三氯甲烷進(jìn)行超聲提取，并對(duì)不同超聲提取時(shí)間進(jìn)行考查。最終確定用甲醇超聲提取30 min，提取成分含量較高，且操作簡(jiǎn)便。

3.4 流動(dòng)相梯度洗脫條件的考查 由于芍藥苷與白花前胡甲素極性差別較大，因此本研究選用梯度洗脫的方法同時(shí)測(cè)定二者含量。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)證實(shí)0～7 min，0.4%磷酸溶液-乙腈為83∶17適于芍藥苷的洗脫，而8～22 min，0.4%磷酸溶液-乙腈為30∶70更適于白花前胡甲素的洗脫，故本研究選擇此梯度作為最終的實(shí)驗(yàn)條件。

1 中國(guó)藥典[S].二部.2010：70，187

2 陳華，姜云平，高朝霞，等．血府逐瘀口服液中芍藥苷含量的測(cè)定[J]．西部醫(yī)學(xué)，2009，21(12):2162-2163

3 符翠莉，郭炎榮．RP-HPLC法測(cè)定頸痛顆粒中葛根素和芍藥苷的含量[J]．中國(guó)藥師，2009，12(11):1555-1557

4 李娉婷，陳子?jì)?，賈薇，等．中藥膠囊劑中芍藥苷含量測(cè)定方法優(yōu)化[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25(10):2355-2357

5 陳慧真，婁偉建．不同廠家烏雞白鳳丸中芍藥苷含量的HPLC測(cè)定[J]．中國(guó)中藥雜志，2008，33(19):2275-2276

6 李紅燕，張蕊，馮小川．HPLC 測(cè)定除痰止嗽丸中的桔梗皂苷 D桔梗皂苷 E 白花前胡甲素和白花前胡乙素[J]．中國(guó)試驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(2):86-90

7 黃瑞紅，楊慧文．RP-HPLC法測(cè)定清肺抑火丸中白花前胡甲素的含量[J]．中國(guó)藥房，2010，21(27):2556-2557

8 周卿，楊建文，鄭天宇．RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定寶咳寧顆粒中4種成分[J]．中成藥，2014，36(8):1678-1681

9 鄭世存，李曉宇，歐陽(yáng)冰，等.芍藥苷藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國(guó)藥物警戒，2012,9(2):100-103

10 薛俊超．白花前胡化學(xué)成分及相關(guān)藥理作用的研究進(jìn)展[J]．海峽藥學(xué)，2012，24(2):34-38

2016-03-02

R927.2

A

1006-5687(2016)05-0028-03

*通迅作者：林宏，E-mail：roylinvip@126.com。