鄭錦輝，駱 翔，宋艷志，鄧意輝

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聚唾液酸衍生物/泊洛沙姆407混合膠束中多西他賽的含量測(cè)定

鄭錦輝，駱 翔，宋艷志，鄧意輝*

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016)

目的建立聚唾液酸衍生物P-G/泊洛沙姆407混合膠束中多西他賽含量的測(cè)定方法。方法采用溶劑法處理樣品，并用HPLC法測(cè)定混合膠束中多西他賽的含量。色譜柱為Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流動(dòng)相為乙腈-水（體積比55∶45），流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。結(jié)果體積分?jǐn)?shù)為55%乙腈水溶液可完全破壞混合膠束且多西他賽回收率較高；空白膠束載體材料與多西他賽峰分離度良好，對(duì)多西他賽含量測(cè)定無干擾；多西他賽質(zhì)量濃度在0.98~117.60 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，=0.999 8；日內(nèi)、日間精密度RSD均小于2.0%；低、中、高3種質(zhì)量濃度樣品回收率均在95%~105%內(nèi)，平均回收率為98.4%，RSD小于2.0%。結(jié)論該方法可用于混合膠束中多西他賽的含量測(cè)定。

藥劑學(xué)；含量測(cè)定；高效液相色譜法；多西他賽；聚唾液酸衍生物；泊洛沙姆407

多西他賽（docetaxel，DTX）又稱多西紫杉醇（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），是由法國(guó)羅納普朗克·樂安公司開發(fā)的第二代紫杉烷類抗腫瘤藥[1]，其作用機(jī)制是通過與細(xì)胞內(nèi)的微管結(jié)合、穩(wěn)定并防止其解聚，將細(xì)胞阻滯于G2/M期，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。與第一代紫杉烷類藥物紫杉醇相比，其抗癌活性提高了1.3~12倍[2]，被認(rèn)為是臨床應(yīng)用中最有效的化療藥[3]。目前，主要應(yīng)用于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、頭頸癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卵巢癌以及前列腺癌等多種癌癥的治療[4]。

Fig. 1 Chemical structure of docetaxel

圖1多西他賽化學(xué)結(jié)構(gòu)式

由于DTX水溶性較差，目前上市制劑采用吐溫80對(duì)其增溶，但吐溫80易引起患者產(chǎn)生過敏、神經(jīng)毒性和腎毒性等不良反應(yīng)，因此有必要開發(fā)新的劑型[5]。

近年來，兩親性聚合物膠束以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)在難溶性藥物増溶及腫瘤藥物靶向遞送方面取得了顯著進(jìn)展。聚合物膠束通常粒徑較小（一般10~100 nm），外殼具有柔韌性和親水性，能夠有效避免單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的識(shí)別并借助實(shí)體瘤的高滲透長(zhǎng)滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)達(dá)到被動(dòng)靶向目的；另外，在聚合物膠束表面修飾唾液酸、甘露糖、葉酸等配體后，還可實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向功能[6-7]。

在膠束載體材料的選擇方面，泊洛沙姆（Poloxamer）系列因其具有無毒、無免疫原性、生物相容性好等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。泊洛沙姆由聚氧乙烯（poly (ethylene oxide)，PEO）-聚氧丙烯（poly (propylene oxide), O）-聚氧乙烯（PEO）三嵌段構(gòu)成，隨著親水EO（ethylene oxide，EO）鏈和疏水PO（propylene oxide，PO）鏈數(shù)目的不同，具有不同的親水親油平衡值（hydrophilic lipophilic balance，HLB）、臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）和油水分配系數(shù)[8]。常見的泊洛沙姆型號(hào)包括Kolliphor?F 68（P188）、F87（P237）、F108（P338）和F127（P407），其中P188和P407以其較低的毒性已被收載入《美國(guó)藥典》。與P188相比，P407的CMC值較低，更適用于膠束的制備[9-10]。

在靶向配基的選擇方面，唾液酸及其衍生物具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸（sialic acid，SA）修飾的脂質(zhì)體能夠靶向小鼠S180 腫瘤，50%的荷瘤小鼠被治愈，并且2個(gè)月內(nèi)不復(fù)發(fā)腫瘤[11]。但是由于該材料的親水性較弱，制劑粒徑較大，穩(wěn)定性較差，因此，本課題組希望利用親水性更好的聚唾液酸（polysialic acid，PSA）替代SA，首次合成了PSA兩親性衍生物（P-G），并將其修飾于P407膠束表面，以期同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的被動(dòng)和主動(dòng)靶向功能。本文主要報(bào)道混合膠束樣品的處理方法和含量測(cè)定的方法，為制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（配有UV228紫外檢測(cè)器、P230高壓恒流泵，大連依利特分析儀器有限公司），HW-2000色譜數(shù)據(jù)處理工作站（大連依利特色譜有限公司），BS124s分析天平（德國(guó)Sartorius公司），Anke TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），KQ5200B超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），F(xiàn)DU-110凍干機(jī)（日本東京理化器械股份有限公司），Hypersil BDS C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司）。

多西他賽（docetaxel，DTX，上海新先鋒藥業(yè)有限公司），泊洛沙姆407（Kolliphor? F 127，P 407，德國(guó)BASF公司），聚唾液酸衍生物（P-G，實(shí)驗(yàn)室自制），無水乙醇（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司），甲醇（色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠），乙睛（色譜純，美國(guó)Sigma公司），，-二甲基甲酰胺（DMF，分析純，天津博迪化工股份有限公司），二甲基亞砜（DMSO，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠），試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 DTX混合膠束樣品處理方法的研究與確定

2.1.1 樣品處理溶劑的選擇

用乙腈、甲醇、DMSO、DMF、體積分?jǐn)?shù)為55%的乙腈水溶液（流動(dòng)相）作為破壞溶劑，分別考察溶解現(xiàn)象、色譜峰形及DTX的回收率。

對(duì)照溶液：精密稱取DTX原料藥適量，用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度為192 mg·L-1的DTX溶液，作為對(duì)照溶液。

樣品溶液：精密稱取DTX混合膠束凍干內(nèi)容物適量，分別加入乙腈、甲醇、DMF、DMSO、體積分?jǐn)?shù)為55%乙腈水溶液各1 mL，渦旋3 min，1×104r·min-1離心10 min。將所得到的上清液分別用流動(dòng)相稀釋至質(zhì)量濃度為52、52、30、30和104 mg·L-1的DTX溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見表1和圖2。

Table 1 DTX recoveries in different solvents

Ⅰ—DTX;Ⅱ—P-G; Ⅲ—DMSO; Ⅳ—DMF

結(jié)果表明：混合膠束在乙腈和甲醇溶液中出現(xiàn)白色絮狀不溶物，而在DMSO、DMF和體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液中可形成均一透明溶液，圖2中峰形結(jié)果顯示3種溶劑中DTX峰形均較好；回收率結(jié)果表明，DTX除在甲醇中回收率較低外，在其他4種溶劑中回收率均大于95%，而在DMSO和體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液中有相對(duì)更好的回收率。綜合考慮，選擇體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液作為破壞溶劑。

2.1.2 溶劑比例的考察

對(duì)照溶液：精密稱取DTX原料藥適量，用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的DTX溶液，作為對(duì)照溶液。

樣品溶液：精密量取DTX混合膠束溶液適量，分別加入體積分?jǐn)?shù)35%、45%、55%和75%乙腈水溶液各1 mL，渦旋3 min，1×104r·min-1離心10 min。所得到上清液分別用各溶劑稀釋至質(zhì)量濃度為99 mg·L-1的DTX溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，雖然DTX在體積分?jǐn)?shù)35%乙腈水溶液中回收率略低，但在其余各濃度乙腈水溶液中回收率均大于95%，且4種溶劑中總RSD為2.8%，小于5%，表明乙腈濃度對(duì)DTX回收率影響不大。

Table 2 DTX recoveries in different concentrations of acetonitrile

2.1.3 樣品處理?xiàng)l件的考察

對(duì)照溶液：精密稱取DTX原料藥適量，用流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的DTX溶液，作為對(duì)照溶液。

渦旋時(shí)間考察：精密稱取DTX混合膠束凍干品適量，加入流動(dòng)相1 mL，分別渦旋1、3和5 min，再1×104r·min-1離心10 min。將所得到的上清液分別用流動(dòng)相稀釋至質(zhì)量濃度約為0.1 g·L-1的DTX溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見表3。

離心時(shí)間考察：精密稱取DTX混合膠束凍干品適量，加入流動(dòng)相1 mL，渦旋3 min后，1×104r·min-1下分別離心10、15和20 min。將所得到的上清液分別用流動(dòng)相稀釋至質(zhì)量濃度約為0.1 g·L-1的DTX溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，DTX回收率隨渦旋時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，與離心時(shí)間增長(zhǎng)無明顯趨勢(shì)。另外，僅渦旋時(shí)間為1 min時(shí)回收率小于95%，其他條件下回收率均大于95%。因此，選則渦旋3 min和1×104r·min-1離心10 min作為樣品的處理?xiàng)l件。

Table 3 DTX recoveries under different centrifugation conditions

2.2 混合膠束含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 溶液配制

對(duì)照溶液：取DTX原料藥約10 mg，精密稱定。置于10 mL量瓶中，加入無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的DTX對(duì)照溶液。

供試溶液：取DTX混合膠束凍干品約61 mg，約含DTX 1 mg，精密稱定。加入體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液1 mL使其溶解，渦旋3 min，1×104r·min-1離心10 min，取上清液作為供試儲(chǔ)備液。精密量取供試儲(chǔ)備液0.5 mL，置于5 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得供試溶液。

物理混合溶液：按處方量稱取膠束載體材料及DTX，直接用體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液溶解制成質(zhì)量濃度約為1 g·L-1的DTX溶液。精密量取上述溶液0.5 mL，置于5 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得物理混合溶液。

空白溶液：精密稱取不含DTX的空白混合膠束60 mg，按供試溶液配制方法配制。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

按“2.2.1”條方法配制對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液1.2 mL，置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋制成12 mg·L-1的溶液。取此溶液20 μL，在波長(zhǎng)200~400 nm內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，DTX的最大吸收波長(zhǎng)為230 nm。

2.2.4 專屬性試驗(yàn)

按“2.2.1”條方法配制對(duì)照溶液、空白溶液、物理混合溶液。取流動(dòng)相、對(duì)照溶液、空白溶液和物理混合溶液，按“2.2.2”條色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖3）?？瞻啄z束載體材料與DTX峰分離度為4.8，分離度良好，不干擾DTX的含量測(cè)定。

Ⅰ—Carrier materials in blank micelles ;Ⅱ—Docetaxel

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取DTX原料藥9.8 mg，置于10 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為DTX儲(chǔ)備液。分別精密移取DTX儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋或逐級(jí)稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.98、9.80、29.40、58.80、78.40、98.0和117.60 mg·L-1的DTX溶液，按“2.2.2”條色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以DTX峰面積（）對(duì)質(zhì)量濃度（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：=1.386 8×104- 2.760 9×103，=0.999 8。結(jié)果表明，DTX質(zhì)量濃度在0.98~117.60 mg·L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 檢測(cè)限與定量限的確定

量取“2.2.5”條下的DTX儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，至其所記錄的色譜圖中信號(hào)噪音比值（/）為3和10，分別為定量限和檢測(cè)限。經(jīng)計(jì)算，DTX的定量限和檢測(cè)限分別為19.6 ng和6.9 ng。

2.2.7 精密度試驗(yàn)

日內(nèi)精密度：稱取DTX混合膠束凍干品適量，按“2.2.1”條方法分別配置對(duì)照溶液及6份供試溶液。按“2.2.2”條色譜條件，同日內(nèi)進(jìn)樣檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，6份樣品檢測(cè)平均含量為97.5%，RSD為0.4%，小于2.0%，表明該方法日內(nèi)精密度良好。

日間精密度：每日稱取DTX混合膠束凍干品適量，按“2.2.1”條方法分別配置對(duì)照溶液及供試溶液。按“2.2.2”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 d，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，6次檢測(cè)平均含量為97.3%，RSD為1.0%，小于2.0%，表明該方法日間精密度良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”條中對(duì)照溶液0.5、7.5和1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，再分別加入空白膠束溶液1.0 mL，用流動(dòng)相稀釋至刻度，制成低（約50 mg·L-1）、中（約75 mg·L-1）和高（約100 mg·L-1）3種質(zhì)量濃度的DTX供試溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行配制3份。按“2.2.2”條色譜條件對(duì)上述樣品進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。高、中、低3種質(zhì)量濃度的樣品回收率均在95%~105%內(nèi)，平均回收率為98.4%，RSD為1.9%，小于2.0%，回收率符合要求。

Table 4 Recoveries of DTX

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取混合膠束適量，按“2.2.1”條方法配制供試溶液，室溫放置，分別于0、6、14、24和36 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。經(jīng)計(jì)算，峰面積的RSD為1.4%，小于2.0%，表明供試溶液在室溫條件下36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 DTX混合膠束含量測(cè)定

取3批DTX混合膠束凍干樣品，按“2.2.1”條方法配制對(duì)照溶液和3批混合膠束的供試溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，外標(biāo)法計(jì)算含量。3批樣品的含量分別為100.0%、99.2%和97.3%。

3 討論

3.1 混合膠束供試品處理方法的選擇

由于DTX包裹入混合膠束的疏水內(nèi)核中，所以在含量測(cè)定前，需要對(duì)膠束進(jìn)行破壞。根據(jù)載體材料和DTX的溶解特性，作者嘗試了乙腈、甲醇、DMSO、DMF和體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液作為破壞溶劑。在5種溶劑中，乙腈和甲醇不能完全破壞膠束，溶液中出現(xiàn)白色絮狀不溶物；DMSO、DMF、體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液可完全破壞膠束，溶液均一透明。但HPLC色譜圖顯示，DMSO和DMF處理的樣品，2 min左右出現(xiàn)較大溶劑峰（圖2），雖對(duì)DTX檢測(cè)無干擾，但樣品中DMSO、DMF溶劑濃度過大容易損傷色譜柱；而體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液無溶劑峰，且DTX峰形較好，因此最終選擇體積分?jǐn)?shù)55%乙腈水溶液作為破壞溶劑。

3.2 色譜條件的選擇

DTX含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)雖有一些報(bào)道，其中納米制劑中DTX的含量測(cè)定方法[12-15]主要采用以有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)在65%~75%內(nèi)為流動(dòng)相的HPLC法檢測(cè)，但本品在乙腈-水體積比為65∶35條件下檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，載體材料P-G 對(duì)DTX的檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生干擾，故在此基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)整，當(dāng)調(diào)整乙腈-水體積比為55∶45時(shí)，載體材料P-G對(duì)DTX檢測(cè)無干擾，且保留時(shí)間為5.3 min，檢測(cè)時(shí)間比較合理。

[1] 王麗麗, 侯建玲, 孫曉利, 等. 多西他賽納米制劑的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)新藥與臨床雜志, 2010, 29(10): 721-727.

[2] 于克煒, 劉志紅, 張娜. 多西他賽PluronicF68聚合物膠束的制備與體外評(píng)價(jià)[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 49(11): 156-160.

[3] ZHAO P, ASTRUC D. Docetaxel nanotechnology in anticancer therapy[J]. Chem Med Chem, 2012, 7(6): 952-972.

[4] SWEETMAN S C. Martindale: The Complete Drug Reference[M]. 36th Ed. London: Pharmaceutical Press, 2009: 710-713.

[5] CLARKE S J, RIVORY L P. Clinical pharmacokinetics of docetaxel[J]. Clinical Pharmacokinetics, 1999, 36(2): 99-114.

[6] MAHMUD A, XIONG X B, ALIABADI H M, et al. Polymeric micelles for drug targeting[J]. Journal of Drug Targeting, 2007, 15(9): 553-584.

[7] KEDAR U, PHUTANE P, SHIDHAYE S, et al. Advances in polymeric micelles for drug delivery and tumor targeting[J]. Nanomedicine : NBM, 2010, 6: 714-729.

[8] 劉雯, 李娟. 泊洛沙姆混合膠束的研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2012, 8(8): 216-218.

[9] LIU Liwei, YONG K T, ROY I, et al. Bioconjugated pluronic triblock-copolymer micelle-encapsulated quantum dots for targeted imaging of cancer:andstudies[J]. Theranostics, 2012, 2(7): 705-713.

[10] HHHESCOBAR-CHáVEZ J JHHH, HHHLóPEZ-CERVANTES MHHH, HHHNA?K AHHH, et al. Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations[J]. J Pharm Pharmaceut Sci, 2006, 9(3): 339-358.

[11] SHE Zhennan, ZHANG Ting, WANG Xuling, et al. The anticancer efficacy of pixantrone-loaded liposomes decorated with sialic acideoctadecylamine conjugate[J]. Biomaterials, 2014, 35: 5216-5225.

[12] 鄒瑜, 王淑君, 王思玲, 等. RP-HPLC法測(cè)定多西他賽固體脂質(zhì)納米粒中多西他賽的含量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 11: 700-702.

[13] 楊秀麗, 蒲道俊, 余春梅, 等. 高效液相色譜法測(cè)定多西他賽注射液的含量和有關(guān)物質(zhì)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南, 2012, 18: 77-78.

[14] 胡波, 周郁斌, 楊艷, 等. 超濾-HPLC法測(cè)定注射用多西他賽脂質(zhì)體的含量和包封率[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 02: 132-134.

[15] 于克煒. 多西他賽聚合物膠束的研究[D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué), 2012: 10-11.

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

Determination of docetaxel in mixed micelle of a polysialic acid derivative (P-G) and poloxamer 407

ZHENG Jinhui, LUO Xiang, SONG Yanzhi, DENG Yihui*

（）

ObjectiveTo establish a method for determination of the content of docetaxel in polysialic acid derivatives P-G and poloxamer 407 mixed micelles.Methods AHPLC method was applied to determinate the docetaxel loaded in micelles. The separation was achieved on the Hypersil BDS CB18Bcolumn (200 mm × 4.6 mm, 5 μm). The Mobile phase consisted of acetonitrile-water (∶= 55∶45) at a flow rate of 1.0 mL·min-1and the detection wavelength was set at 230 nm. The column temperature was kept at 30℃.Results The micelles were dissolved in 55% acetonitrile to destroy the micellar structure and dissociate docetaxel from mixed micelles. Docetaxel and carrier materials of micelles could be well separated. A good linear relationship was achieved for docetaxel in the range of 0.98~117.60 mg·L-1,=0.999 8; the intra-day and inter-day precision RSD were less than 2.0%; The recoveries were between 95% and 105%. The average recovery was 98.4% and RSD less than 2.0%.ConclusionThis method can be used for the determination of docetaxel loaded in the mixed micelles.

pharmaceutics; mixed micelles; content determination; docetaxel; polysialic acid derivatives; poloxamer 407

（2016）03–0099–08

10.14146/j.cnki.cjp.2016.03.004

R94

A

2015-10-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373334)

鄭錦輝(1977-), 女(漢族), 遼寧盤錦人, 碩士研究生, E-mail zhengjinh@126.com;

鄧意輝(1964-), 男(漢族), 湖南花坦人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物靶向新劑型的研究, Tel. 024-23986316, E-mail dds-666@163.com。