魏 鳳，張文通，李 峰，沈志強,

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

副豬嗜血桿菌病實驗室診斷方法綜述

魏 鳳1，張文通2，李 峰1，沈志強1,2

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

副豬嗜血桿菌病是引起呼吸系統(tǒng)疾病的重要傳染病之一，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。正確診斷副豬嗜血桿菌病對防治該病極為關(guān)鍵。本文就該病病原分離鑒定、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷三方面展開闡述，以期弄清該病診斷方面的研究進(jìn)展。

副豬嗜血桿菌；診斷方法；綜述

副豬嗜血桿菌?。℉PS）是豬的一種傳染性病癥，以呼吸困難、多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為主要特征。該病主要影響2周齡到4月齡的青年豬。感染豬群主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5～8周齡的豬，發(fā)病率達(dá)20%～30%，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%以上。該病隨著養(yǎng)豬集約化發(fā)展，再加上免疫抑制?。ㄈ缲i圓環(huán)病毒2型病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征等），目前在我國流行日趨嚴(yán)重[1-3]。預(yù)防該病所用的疫苗由于血清型之間的差異，交叉保護(hù)率低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的損失，已成為影響?zhàn)B豬業(yè)最重要細(xì)菌性疾病之一。

防治該病的關(guān)鍵措施之一是對該病病原的確診。依靠對發(fā)病豬群的病史、臨床癥狀、剖檢病變這些傳統(tǒng)診斷方法可以進(jìn)行初步診斷，但弄清病原乃至病原的血清型必須依靠實驗室診斷。自1922年Schermer和Ehrlich分離出該病原以來，科研工作者對該病確診進(jìn)行了大量的研究，取得了顯著成績。本文就該病實驗室診斷方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了如下綜述。

1 細(xì)菌分離鑒定

細(xì)菌的分離培養(yǎng)對確診是十分有必要的，但往往因雜菌的干擾而不能分離成功。

細(xì)菌分離鑒定時應(yīng)當(dāng)采集處于疾病急性期的豬并且沒有使用抗生素的病料，無菌操作條件下采集病豬肺臟、關(guān)節(jié)液、淋巴結(jié)等組織，通常在接種于含NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的巧克力瓊脂平板。在含血清和NAD的TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂）培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，可以觀察到針尖大小、圓形、光滑濕潤、無色透明、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色后顯微鏡下觀察，為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。在無菌操作條件下，挑取上述可疑菌落，水平劃線接種于無 NAD 的綿羊鮮血平皿上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37 ℃培養(yǎng) 24～48 h后，觀察其在葡萄球菌周圍生長情況，應(yīng)出現(xiàn)“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且無溶血現(xiàn)象[3-4]。

2 血清學(xué)診斷

副豬嗜血桿菌病血清學(xué)的診斷方法主要包括補體結(jié)合試驗(CF)，平板凝集試驗、間接血凝試驗(IHA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。

補體結(jié)合試驗，用補體結(jié)合試驗方法檢測副豬嗜血桿菌的抗體，發(fā)現(xiàn)在補體結(jié)合試驗中各種血清型之間具有廣泛的交叉反應(yīng)性。

高艷等利用副豬嗜血桿菌陜西分離株制備平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制備血清抗體，建立副豬嗜血桿菌平板凝集檢測方法。采用本試驗建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法對臨床血清樣品的檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果基本一致。

魏子貢等用超聲波破碎的副豬嗜血桿菌血清4型和血清5型抗原代替副豬嗜血桿菌煮沸物或熱酚水透析物，用醛化鞣酸化的綿羊紅細(xì)胞代替新鮮綿羊紅細(xì)胞，經(jīng)對免疫豬群的抗體水平檢測，免疫豬群2周后抗體檢出率達(dá)89%；對1 665份豬血清進(jìn)行檢測，陽性率為47.1%。該方法敏感性較高，特異性強、重復(fù)性好，可用于疫苗免疫后抗體水平的檢測及副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查。石碧等建立了用莢膜多糖作為包被抗原的間接血凝方法，通過優(yōu)化莢膜最佳生長條件，得到了高質(zhì)量的抗原，從而使抗體檢測的敏感性得到了大大的提高。而Miniats等曾用副豬嗜血桿菌0322株鹽水浸出抗原致敏綿羊紅細(xì)胞檢測陽性血清，結(jié)果表明IHA法與間接ELISA檢測法符合率為65.3%。

李鵬等利用純化融合P2蛋白作包被抗原及優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立了可檢測抗HPS P2蛋白抗體的間接ELISA方法，并用所建立的P2-ELISA與國外進(jìn)口的HPS檢測試劑盒Synbiocits-ELISA對196份臨床送檢血清進(jìn)行平行檢測，陽性符合率為93.4%。臧瑩安等利用副豬嗜血桿菌OMP P5基因表達(dá)并純化復(fù)性后蛋白作為包被蛋白，建立針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5的間接ELISA抗體檢測方法， 通過對進(jìn)行和未進(jìn)行 HPS免疫的健康豬血清的檢測，證實了建立的間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強、反應(yīng)快速準(zhǔn)確等特點，可用于HPS的快速診斷。鄭念廣等采用121 ℃高壓處理副豬嗜血桿菌4型和5型耐熱蛋白，混合作為包被抗原，建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法。結(jié)果表明敏感性比間接血凝試驗高與國外ELISA試劑盒一致，可用于副豬嗜血桿菌的血清抗體檢測和血清流行病學(xué)調(diào)查。馮小明等采用超聲裂解的副豬嗜血桿菌菌體上清作為包被抗原,建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法。建立的間接ELISA方法的特異性和重復(fù)性良好,敏感性比間接血凝試驗高,可用于副豬嗜血桿菌的檢疫和流行病學(xué)調(diào)查 。

3 分子生物學(xué)檢測

在動物傳染性疾病的診斷研究中，分子生物學(xué)方法的引入，大大提高了診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，特別是對一些生長緩慢的病原體所致的疾病的診斷的發(fā)展。

根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計的引物建立的PCR診斷方法可以從臨床樣品中檢測出副豬嗜血桿菌，這種方法檢測的最小細(xì)菌濃度為102CFU/mL，其敏感性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的細(xì)菌分離方法。劉建奎等針對副豬嗜血桿菌16 S rRNA序列設(shè)計1對特異性引物，并據(jù)此建立了快速準(zhǔn)確鑒定副豬嗜血桿菌PCR方法，13份疑似病料檢測結(jié)果表明，PCR檢測結(jié)果與傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)果符合率為100%。

車勇良等建立一種可快速檢測副豬嗜血桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）方法。是常規(guī)PCR檢測最低限的100倍，顯示出較高的敏感性。

2013年，李富祥等根據(jù)副豬嗜血桿菌16 S rRNA基因的保守序列設(shè)計特異性引物和TaqMan探針，建立了副豬嗜血桿菌TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果表明，該方法最低可檢測到6.92×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品陽性質(zhì)粒；臨床樣品檢測結(jié)果表明，該方法可用于副豬嗜血桿菌感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查以及副豬嗜血桿菌的定量分析。羅寶正等參考 GenBank 已發(fā)表的副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)錄起始因子infB基因序列設(shè)計特異性引物和探針，建立基于TaqMan探針熒光PCR技術(shù)檢測副豬嗜血桿菌的方法。結(jié)果表明 TaqMan 探針熒光 PCR 方法和細(xì)菌分離方法的檢測效果一致。

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2017-03-17）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊項目 SDAIT-08-17

魏鳳，女（1979-），河南遂平人，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究，E-mail：hzndzwt1@163.com