石遠(yuǎn)菊，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，韋冠東，胡玲玲，龍冬梅，楊 偉，葉 麗

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豬瘟分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

石遠(yuǎn)菊，湯德元*，曾智勇，王 彬，黃 濤，韋冠東，胡玲玲，龍冬梅，楊 偉，葉 麗

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著我國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。文章主要針對(duì)豬瘟病毒的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄巢式PCR技術(shù)、多重反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)等5種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期提高對(duì)豬瘟病毒早期感染和隱性帶毒豬的檢出率，淘汰野毒感染豬群，為豬瘟的凈化和防控提供重要診斷參考依據(jù)。

豬瘟；分子生物學(xué)；快速診斷；檢測(cè)技術(shù)

豬瘟（Classical swine fever CSF）又名古典豬瘟、豬霍亂，我國(guó)又將其稱為爛腸瘟，是由豬瘟病毒(Classical swine fever Virus，CSFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以發(fā)病急、高熱稽留和細(xì)小血管壁變性，引起全身皮膚、黏膜和漿膜泛發(fā)性小出血點(diǎn)，脾臟梗死為特征。豬瘟的發(fā)生沒(méi)有季節(jié)性，各種年齡段和不同種類的豬群均可感染，典型豬瘟發(fā)病率和死亡率都高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。全世界許多國(guó)家都對(duì)該病制定了根除計(jì)劃，據(jù)報(bào)道，有的國(guó)家已經(jīng)成功地凈化了豬瘟。我國(guó)是發(fā)展中國(guó)家，物力和財(cái)力有限，對(duì)歐洲國(guó)家采取的檢疫撲殺措施難以承受。近年來(lái)，隨著豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛使用，我國(guó)豬瘟的流行情況和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，主要表現(xiàn)為：病程明顯延長(zhǎng)，由急性和亞急性轉(zhuǎn)變?yōu)槁詾橹?；病原毒力降低，易出現(xiàn)持續(xù)感染、胎盤垂直感染、妊娠母豬帶毒綜合征及新生仔豬的免疫耐受等，發(fā)病率和死亡率明顯下降；流行情況從頻發(fā)的大流行轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)律的地區(qū)性散發(fā)性流行，疫點(diǎn)顯著減少；臨床癥狀由典型轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫蜏睾托载i瘟和母豬帶毒綜合征。豬瘟的非典型性給豬瘟的診斷帶來(lái)了新的困難，盡管常規(guī)的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷（豬體回歸感染試驗(yàn)、兔體交叉免疫試驗(yàn)、病毒分離鑒定、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、免疫膠體金技術(shù)、金標(biāo)卡診斷、新城疫病毒強(qiáng)化試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、髓細(xì)胞檢查法、免疫酶測(cè)定技術(shù)或酶標(biāo)記抗體診斷法和單克隆抗體免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)等）對(duì)豬瘟的診斷有一定的幫助，但分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)以其高特異性、高靈敏性在廣大的科研實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。

CSFV的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要包括：普通反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄巢式PCR(Nested RT-PCR)技術(shù)、多重反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mRTPCR)技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RTFQ RT-PCR)技術(shù)及環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù)等，現(xiàn)將這些分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展分述如下：

1 RT-PCR技術(shù)

RT-PCR技術(shù)是將扁桃體活體組織或病死豬的扁桃體、淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟和大腦等組織研磨，提取RNA，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增合成目的片段。該技術(shù)特異性較強(qiáng)、靈敏度較高、重復(fù)性好、易操作，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程只需要幾個(gè)小時(shí)就能達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

國(guó)外TitovI[1]等建立了RT-PCR技術(shù)和高分辨率融合（HRM）分析相聯(lián)合來(lái)鑒別CSFV疫苗株和野毒株的快速方法。該方法首先利用CSFV E2基因的最可變區(qū)的短片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，隨后再用HRM來(lái)分析擴(kuò)增的目的片段。實(shí)時(shí)PCR/HRM用于CSFV檢測(cè)和分化分析具有與RT-qPCR和基因分型相當(dāng)?shù)撵`敏度分辨率且與E2核苷酸測(cè)序相當(dāng)。該方法僅用一個(gè)步驟就能在現(xiàn)場(chǎng)樣品中進(jìn)行CSFV的快速、靈敏的鑒定以及基因型的鑒別，操作簡(jiǎn)單，對(duì)于基層豬瘟的快速診斷是非常有價(jià)值的。

秦玉明[2]在國(guó)內(nèi)外首次建立了原位RT-PCR法，該方法能檢測(cè)組織切片中的CSFV RNA分子，在檢測(cè)病毒的同時(shí)還可以初步觀察到組織的病理變化，將豬瘟病理學(xué)研究由組織病理學(xué)水平發(fā)展到分子病理學(xué)水平，為以后研究豬瘟的隱性感染和持續(xù)性感染的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。郭抗抗[3]等建立了一種能區(qū)分CSFV強(qiáng)毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR檢測(cè)方法，該方法可以從CSFV強(qiáng)毒株和兔化弱毒疫苗株中分別擴(kuò)增出大小為187 bp和492 bp的特異性片段，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等豬源性病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，利用該方法可以從10份疑似豬瘟臨床樣品中分別檢測(cè)出豬瘟強(qiáng)毒和疫苗毒，說(shuō)明該研究建立的RT-PCR方法具有較好的特異性，為豬瘟的早期診斷及疫苗免疫豬和野毒感染豬的鑒別提供了技術(shù)參考。

陳本龍[4]等成功建立了一種能夠區(qū)分豬瘟病毒強(qiáng)毒株HCLV株的RTPCR檢測(cè)方法，該法從豬瘟強(qiáng)毒株和兔化弱毒株中擴(kuò)增出了大小分別為680 bp和785 bp的特異性片段，具有高度的特異性和敏感性。吳旭錦[5]等建立了豬瘟病毒的RT-nPCR檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)CSFV cDNA含量的最低極限為6.7×10-5ng/L，從BVDV，PRRSV，PCV2，PRV和PPV等參考毒株中提取或反轉(zhuǎn)錄獲得的DNA/cDNA中不能擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)。

湯德元[6]等通過(guò)對(duì)GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因組全序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)豬瘟兔化弱毒疫苗株3'-NTR獨(dú)立存在富含T的插入序列，根據(jù)這一特點(diǎn)分別在該插入序列的上、下兩端設(shè)計(jì)2對(duì)單一RTPCR引物并選擇特異保守區(qū)域設(shè)計(jì)了二重RT-PCR引物，優(yōu)化篩選能夠鑒別豬瘟野毒與兔化弱毒疫苗的PCR反應(yīng)條件，建立了能鑒別豬瘟野毒和疫苗毒的單一與二重RT-PCR的鑒別診斷方法，該方法從豬瘟野毒株和兔化弱毒株中擴(kuò)增出了大小分別為372 bp和140 bp的特異性片段；利用該方法進(jìn)行敏感性和特異性分析，單一RT-PCR檢測(cè)CSFV各引物最低核酸檢測(cè)量分別為2.2 pg(單一RT-PCR中的1對(duì)引物)和1.7 pg(單一RT-PCR中的另外1對(duì)引物)；二重RT-PCR檢測(cè)CSFV各引物最低核酸檢測(cè)量分別為8.2 pg（豬瘟野毒)和6.7 pg（豬瘟疫苗毒)，兩種方法均未檢測(cè)到PRV，PRRSV，JEV，BVDV，PCV2的DNA/RNA；此外，還采用該方法對(duì)146份可疑臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，豬瘟疫苗毒與野毒在繁殖母豬、育肥豬、保育豬和哺乳仔豬中的二重感染率分別為6.3%，7.4%，8.3%，8.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：?jiǎn)我慌c二重RT-PCR方法均具有敏感性強(qiáng)、特異性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，該研究對(duì)規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟的凈化具有十分重要的參考價(jià)值。

2 Nested PCR技術(shù)

Nested PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)，使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似，第二對(duì)引物（又稱為巢式引物）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的優(yōu)點(diǎn)在于：如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，Nested PCR的擴(kuò)增特異性高。

羅勇[7]利用序列分析軟件（VectorNTI8），對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中不同國(guó)家和地區(qū)發(fā)布的29株豬瘟野毒及6株疫苗毒株的E2基因序列及BVDV基因序列的相應(yīng)位置進(jìn)行了比較分析，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，外套引物擴(kuò)增E2基因中目的片段，大小為806 bp，內(nèi)套引物擴(kuò)增大小為512 bp。經(jīng)各種反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了豬瘟病毒套式RT-PCR檢測(cè)方法，運(yùn)用該方法對(duì)中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供的19株CSFV的核酸及6種豬源常見(jiàn)病原的核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果顯示：19株CSFV的核酸樣品檢測(cè)均呈陽(yáng)性，其他樣品則為陰性；該方法的靈敏度與real-time RT-PCR相當(dāng)，比普通RT-PCR提高了100倍。

楊若松[8]等建立的豬瘟病毒巢式RT-PCR檢測(cè)方法可以從拷貝數(shù)為102/μL的豬瘟病料中檢測(cè)到CSFV，具有很高的特異性、靈敏性、復(fù)核率以及重復(fù)性，而且建立的豬瘟病毒巢式RTPCR方法的引物序列均在具有CSFV序列的保守區(qū)，具有更好的應(yīng)用前景。

劉梅芬[9]等參照GenBank中公布的CSFV E2基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，以CSFV總RNA為模板，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立CSFV nested RTPCR方法，利用所建立的方法對(duì)35份臨床疑似CSFV感染樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到19個(gè)陽(yáng)性樣品，并對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行克降測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)果表明：成功建立了CSFV nested RT-PCR檢測(cè)方法，能夠特異性地?cái)U(kuò)增CSFV，但對(duì)ST正常細(xì)胞對(duì)照和其他8種病原對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，敏感性高，最低檢測(cè)病毒含量為1 TCID50/mL，適合早期檢測(cè)CSFV。

3 mPCR技術(shù)

多重PCR（mutiplex PCR）技術(shù)是PCR技術(shù)中的一種，該技術(shù)是在同一PCR管中加入多對(duì)特異性引物和多個(gè)對(duì)應(yīng)的模板，之后進(jìn)行PCR反應(yīng)，在一個(gè)PCR管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)DNA分子。多重PCR技術(shù)可以擴(kuò)增一個(gè)病毒的一個(gè)片段，也可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)病毒的不同片段，它具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于各種病毒性疫病的快速診斷。

薛媛[10]針對(duì)PRRSV、CSFV和JEV的保守性基因序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物用于擴(kuò)增各目的基因序列，通過(guò)對(duì)引物濃度、退火溫度、Mg2+濃度等反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了鑒別PRRSV，CSFV，JEV多重RT-PCR的診斷方法，其敏感性可達(dá)到CSFV 10-1pg，PRRSV 10-2pg，JEV 10-3pg級(jí)；此外，還具有較好的特異性，對(duì)CSFV，PRRSV，JEV己知陽(yáng)性病料均能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，該方法為這3種病原的臨床診斷與鑒別提供了可供參考的方法。

Liu[11]等建立的多重RT-PCR技術(shù)可同時(shí)也可單獨(dú)檢測(cè)出PRRSV、GSFV和PCV2，其特異性、靈敏性較高，檢測(cè)3種病毒的靈敏度分別為2.0×104，2.5×103，6.0×102個(gè)拷貝數(shù)。

湯德元[12]等根據(jù)GenBank登錄的豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒和豬流感病毒6種常見(jiàn)病毒的相關(guān)保守基因序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過(guò)對(duì)其條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)以上6種病毒的PCR/RT-PCR診斷方法，通過(guò)試驗(yàn)證明：該檢測(cè)方法具有良好的特異性和敏感性，為檢測(cè)以上6種病毒提供了參考。湯德元[13]等還針對(duì)PRRSV，CSFV和SIV等3種常見(jiàn)病毒的相關(guān)保守基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)對(duì)其條件的優(yōu)化，建立了3種呼吸道病毒的三重RT-PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了上述3種病毒的同步檢測(cè)，能快速、準(zhǔn)確地對(duì)臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，是一種實(shí)用、快速的檢測(cè)方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。湯德元[14]等通過(guò)比對(duì)分析GenBank中登錄的CSFV和PRV的相關(guān)基因序列，分別設(shè)計(jì)可以區(qū)分CSFV與PRV及其疫苗株的5對(duì)特異性引物，建立了其多重PCR鑒別檢測(cè)的方法，建立的多重PCR方法對(duì)CSFV和PRV擴(kuò)增為陽(yáng)性，而對(duì)PCV2、PRRSV、JEV和BVDV擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；最低核酸檢測(cè)量分別為1.7×103拷貝/ μL（CSFV野毒株）、9.9×103拷貝/ μL(CSFV-C疫苗株)、1.3×103拷貝/μL（Guizhou-DY）、6.9×103拷貝/μL(Bartha-K61)和5.5×103拷貝/μL(SA215)。該研究建立的多重PCR方法為從病原學(xué)方面快速鑒別CSF和PR疫苗毒與野毒提供了新的技術(shù)支撐，為規(guī)?；i場(chǎng)實(shí)現(xiàn)豬瘟與豬偽狂犬病的凈化提供一種新方法。湯德元[15]通過(guò)對(duì)多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，以及臨床應(yīng)用檢測(cè)，成功建立了能同時(shí)檢測(cè)PRV、PCV2、CSFV和SIV 4種病毒的多重PCR方法，還建立了能同時(shí)檢測(cè)PRV、PCV2、CSFV、PRRSV和SIV 5種病毒的多重PCR方法，以及能同時(shí)檢測(cè)PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV和SIV 6種病毒的多重PCR方法，建立的多重PCR最低檢測(cè)限均達(dá)到pg級(jí)水平，且具有較高的特異性。

冷依伊[16]等根據(jù)GenBank中登錄的參考病毒株序列，選擇非洲豬瘟病毒(ASFV)、水皰性口炎病毒(VSV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬瘟病毒(CSFV)以及豬偽狂犬病病毒(PRV)的保守序列設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種可以同時(shí)且快速檢測(cè)以上5種病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法，該方法對(duì)不同的細(xì)菌或病毒模板擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，特異性強(qiáng)；對(duì)PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少檢出量分別為8.82×103拷貝/ μL、6.87×104拷貝/μL、5.71拷貝/μL、4.93×104拷貝/μL和4.32×102拷貝/μL。以上結(jié)果表明：該方法快速、靈敏、特異性強(qiáng)，對(duì)以上5種豬病病毒能夠進(jìn)行快速鑒別檢測(cè)，為其臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的檢測(cè)方法。

王苗苗[17]等為了建立能夠同時(shí)檢測(cè)豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬細(xì)小病毒（PPV）的多重PCR，并用于豬場(chǎng)感染情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)控以及臨床診斷，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的5種病毒的基因序列，針對(duì)CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因，分別設(shè)計(jì)了特異性引物。在建立的單項(xiàng)PCR基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了能同時(shí)檢測(cè)5種病毒的多重PCR，采用建立的多重PCR對(duì)127份疑似病豬的扁桃體活體組織進(jìn)行檢測(cè)，檢出了5種病毒的存在，其中感染2種及以上病毒的樣品比例為39.6%（49/127），表明該方法是一種特異、快速、靈敏、高效的病原學(xué)檢測(cè)手段。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTFQ PCR)技術(shù)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。其原理是在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，加入1對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針或SYBR GreenI熒光染料，該探針或染料為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開(kāi)始時(shí)，探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。RTFQ PCR技術(shù)通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離PCR產(chǎn)物，即能準(zhǔn)確定量起始模板數(shù)；與普通PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化、程度高等優(yōu)點(diǎn)。

Pérez和Lester Josué[18]等描述了一種Real-time RT-PCR方法檢測(cè)CSFV，該方法是基于SYBR Green結(jié)合溶解曲線分析，在兩種Real-time PCR平臺(tái)進(jìn)行分析和檢測(cè)并相互比較，其靈敏度較高，細(xì)胞培養(yǎng)和血清中CSFV最低可以檢測(cè)0.1 TCID50/反應(yīng)，組織為1 TCID50/反應(yīng)，去離子水、血清及組織中分別為1，10，100拷貝數(shù)/μL。Haines[19]等建立的多重實(shí)時(shí)RT-PCR方法能夠同時(shí)檢測(cè)CSFV及ASFV，同時(shí)檢測(cè)的靈敏性度為100%，特異性為CSFV100%，ASFV為97.3%。

石順利[20]根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬瘟保守基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，成功構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系靈敏度可以達(dá)到1×102拷貝的數(shù)量級(jí)，能特異性的與牛病毒性腹瀉黏膜病毒(BVDV)、羊口瘡病毒和羊痘病毒的區(qū)分。饒品彬[21]建立的EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR，經(jīng)實(shí)時(shí)擴(kuò)增能夠產(chǎn)生6個(gè)目的擴(kuò)增產(chǎn)物熔解峰，從而可同時(shí)對(duì)這六種病毒進(jìn)行檢測(cè)和區(qū)分。其中PCV2，PRRSV和JEV的檢測(cè)極限達(dá)到100 拷貝/μL，PPV，CSFV檢測(cè)極限可以達(dá)到250 拷貝/μL，PRV的檢測(cè)極限可以達(dá)到500 拷貝/μL；與利用SYBR Green I多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)相同或相關(guān)病毒比較，靈敏度高出10倍左右，具有高度特異性和良好重復(fù)性，并達(dá)到基于探針的多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)水平。

杜冬華[22]等根據(jù)CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差異，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物及1條TaqMan探針，以含CSFV HB株和C-株E2基因的重組質(zhì)粒pBS-E2C和pBS-E2作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了能同時(shí)檢測(cè)CSFV野毒株和疫苗株的雙重TaqMan real-time PCR鑒別檢測(cè)方法。結(jié)果表明：建立的CSFV雙重TaqMan real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與1×101～1×106拷貝/μL之間的E2基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)10 拷貝/μL，且特異性和重復(fù)性很好，該試驗(yàn)建立的TaqMan real-time PCR檢測(cè)方法可用于CSFV野毒株和疫苗株的鑒別診斷及病原定量分析，將為我國(guó)CSFV野毒株感染及疫苗免疫情況的調(diào)查與分析提供高效、快速的檢測(cè)手段，進(jìn)而為更好的防控豬瘟的發(fā)生和流行奠定基礎(chǔ)。

5 RT-LAMP技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是眾多核苷酸擴(kuò)增技術(shù)中的一種，其基本原理是針對(duì)靶序列的6個(gè)特異部位設(shè)計(jì)4條引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶序列高效擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是檢測(cè)CSFV的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，它的一系列引物是基于E2基因序列設(shè)計(jì)的，然后在63 ℃下孵育50 min進(jìn)行病毒RNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)梯形分布來(lái)判定，還可以通過(guò)直接離心擴(kuò)增產(chǎn)物觀察白色沉淀的生成并借助于專用比濁儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，另外還可在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green I，根據(jù)顏色變化判定擴(kuò)增結(jié)果。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法是一種新興的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌病和病毒病的檢測(cè)，與其他檢測(cè)技術(shù)相比，該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快、無(wú)特殊設(shè)備要求，適用于基層及現(xiàn)場(chǎng)診斷使用。

Chowdry[23]等建立并且評(píng)估一種新型結(jié)合橫向流動(dòng)油量尺檢測(cè)CSFV的LAPM技術(shù)(RT-LAPM-LFD)，這種RT-LAMP-LFD測(cè)定法結(jié)合了CSFV RNA的有效一步等溫?cái)U(kuò)增和LFD的簡(jiǎn)單性，在2～5 min內(nèi)就可快速讀取結(jié)果，此方法靈敏性高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，而且檢測(cè)成本低，這種RT-LAMP-LFD測(cè)定有望成為診斷豬瘟的快速、簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)的新技術(shù)。

何文博[24]建立了豬瘟強(qiáng)毒株與弱毒疫苗株的LAMP檢測(cè)技術(shù)，用建立的LAMP方法和RT-PCR方法檢測(cè)20份豬病料，符合率為90.91%，說(shuō)明該方法是一種快速準(zhǔn)確、特異性好、靈敏度高，適合基層使用的方法，真正實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原微生物核酸的特異、敏感、高效和快捷檢測(cè)，為我國(guó)豬瘟防控與凈化提供技術(shù)支撐，對(duì)動(dòng)物疫病多重感染的鑒別檢測(cè)具有重要意義。張改平[25]等建立的豬瘟強(qiáng)弱毒LAMP檢測(cè)方法，特異性好，比RT-PCR靈敏度高出1 000倍，且重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，為快速準(zhǔn)確地鑒別豬瘟野毒感染和疫苗接種感染提供了有效的方法。

朱俊靈[26]等針對(duì)CSFV NS5B基因設(shè)計(jì)一套特異性引物及生物素標(biāo)記探針，結(jié)合異硫氰酸熒光素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，建立RT-LAMP-LFD檢測(cè)方法，所建立的方法能夠特異地檢測(cè)出CSFV的存在，檢測(cè)PRRSV，JEV，PCV2等其他病毒均為陰性；所建立的CSFVRT-LAMP方法對(duì)RNA的最低檢測(cè)限為50 pg；反應(yīng)快速，整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成；操作簡(jiǎn)單，不需要PCR儀等復(fù)雜的儀器，結(jié)果可經(jīng)肉眼觀察，應(yīng)用RT-LAMP-LFD檢測(cè)CSFV特異性強(qiáng)、靈敏度高，并且操作安全、簡(jiǎn)便、快捷，可以滿足基層檢疫的需要。

總之，豬瘟的診斷方法較多，其中間接血凝試驗(yàn)（IHA）被農(nóng)業(yè)部推薦為豬瘟疫苗抗體檢測(cè)的主要方法，也是我國(guó)豬瘟抗體檢測(cè)的經(jīng)典方法，在國(guó)內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用，為我國(guó)豬瘟的綜合防控做出了巨大貢獻(xiàn)，但該方法敏感性低，待測(cè)血清樣品需經(jīng)滅活處理，增加了檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)難度，且血清的質(zhì)量嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果，誤差較大，不適合準(zhǔn)確檢測(cè)豬瘟抗體水平，養(yǎng)殖場(chǎng)及廣大養(yǎng)殖戶可根據(jù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確程度的實(shí)際需要選擇應(yīng)用；豬瘟熒光抗體(CSF-FA)檢測(cè)豬瘟病毒是一種靈敏性高特異好的診斷方法,該方法是用冰凍組織切片或觸片的直接熒光抗體試驗(yàn)作為豬瘟的法定診斷方法，目前在許多國(guó)家和地區(qū)均已實(shí)行，但在基層受儀器設(shè)備和人員技術(shù)的影響；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有微量、敏感、特異、高通量的優(yōu)點(diǎn)，可用于豬瘟抗體水平監(jiān)測(cè)，但其需要酶標(biāo)儀等儀器設(shè)備，且操作人員需有一定的專業(yè)技術(shù)水平，適合具有基本試驗(yàn)條件的基層實(shí)驗(yàn)室；分子生物學(xué)的普通RT-PCR方法敏感性有限，且不能對(duì)病毒進(jìn)行定量；與普通RT-PCR方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有敏感性更高、特異性更強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)、自動(dòng)化檢測(cè)、不需核酸電泳檢測(cè)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，成為目前豬瘟病毒檢測(cè)中最準(zhǔn)確的方法，雖然該技術(shù)需要價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備、試劑，但隨著國(guó)家對(duì)動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室建設(shè)資金投入的不斷增加，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)將逐步成為豬瘟病毒檢測(cè)中最準(zhǔn)確、適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的方法，不斷為我國(guó)豬瘟的綜合防控事業(yè)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。多重RT-PCR能夠同時(shí)且快速地檢測(cè)出多種不同的病毒，敏感性好、特異性高，具有廣闊的應(yīng)用前景，比較節(jié)省時(shí)間，但是建立一種多重PCR診斷方法不是件容易的事情，在多重PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，它決定著多重PCR反應(yīng)的成功與否，此外，還需要對(duì)引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-LAMP)方法與傳統(tǒng)CSFV診斷方法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法相比，該方法不需要特殊設(shè)備要求，與普通RT-PCR相比，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，靈敏度高了10倍，特別適用于基層及現(xiàn)場(chǎng)診斷使用。

[1] TITOV I, TSYBANOV S, MALOGOLOVKIN A. Genotyping of classical swine fever virus using high-resolution melt analysis[J]. Journal of virological methods, 2015, 224﹕ 53-57.

[2] 秦玉明.豬瘟病毒原位RT-PCR檢測(cè)方法的建立及分子致病機(jī)理的初步研究[D].北京：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,2003.

[3] 郭抗抗,鄧力,井勇,等.豬瘟病毒強(qiáng)毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鑒別檢測(cè)方法的建立[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010(6)﹕13-18.

[4] 陳本龍,張立懷,王建華,等.鑒別豬瘟病毒強(qiáng)毒和疫苗弱毒的RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫2013,30(11)﹕71-74.

[5] 吳旭錦,朱小甫.豬瘟病毒RT-nPCR檢測(cè)方法的建立及陜西部分地區(qū)豬瘟病毒E0基因分子特征分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014(10)﹕15-21.

[6] 馬萍,李達(dá),湯德元,等.鑒別豬瘟野毒與疫苗毒的單一與二重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2016，43(9)﹕2230-2239.

[7] 羅勇.豬瘟病毒套式RT-PCR檢測(cè)方法的建立和種豬場(chǎng)豬瘟免疫與凈化研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[8] 楊若松,寇曉晶,李敬,等.豬瘟巢式RT—PCR監(jiān)測(cè)方法的建立[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息,2013,(12)﹕22.

[9] 劉梅芬,王淑娟,閆若潛,等.豬瘟病毒巢式RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2016(9)﹕2285-2290.

[10] 薛媛.CSFV、PRRSV和JEV多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及PRRSV GP5和N蛋白的原核表達(dá)[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2009.

[11] LIU J K, WEI C H, YANG X Y, et al. Multiplex PCR for the simultaneous detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, classical swine fever virus, and porcine circovirus in pigs[J]. Molecular and cellular probes, 2013, 27(3)﹕149-152.

[12] 韋冠東,王洪光,馬萍,等.豬呼吸道病相關(guān)的常見(jiàn)病毒PCR/RTPCR檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015(12)﹕45-48.

[13] 韋冠東，王洪光，湯德元,等.PRRSV、CSFV與SIV三重RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 畜牧與獸醫(yī),2015(10)﹕109-111.

[14] 李達(dá)，馬萍，湯德元，等.豬瘟和豬偽狂犬野毒與其疫苗株多重PCR鑒別方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2017(2)﹕127-132.

[15] 王洪光.豬呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立與應(yīng)用研究[D] .貴陽(yáng)：貴州大學(xué),2015.

[16] 冷依伊,任梅滲,蒙正群,等. 5種豬病毒性傳染病病原的多重PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2017 (2)﹕123-126.

[17] 王苗苗,張凡慶,王曼,等. 豬五種繁殖障礙性疫病病原體多重PCR的建立及初步應(yīng)用[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2017，38(3)﹕27-31.

[18] PEREZ L J, De ARCE H D, TARRADAS J, et al. Development and validation of a novel SYBR Green real-time RT-PCR assay for the detection of classical swine fever virus evaluated on different real-time PCR platforms[J]. Journal of virological methods, 2011, 174(1)﹕ 53-59.

[19] HAINES F J, HOFMANN M A, KING D P,et al. Development and validation of a multiplex, real-time RT PCR assay for the simultaneous detection of classical and African swine fever viruses[J]. PloS one, 2013, 8(7)﹕ e71019.

[20] 石順利.檢測(cè)豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[21] 饒品彬.EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR同時(shí)檢測(cè)多種豬病毒研究[D].杭州：浙江理工大學(xué),2014.

[22] 杜冬華,薛擁志,王愛(ài)華,等. 豬瘟病毒野毒株與疫苗株E2基因雙重TaqMan real-time PCR鑒別檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015(12)﹕1898-1902.

[23] CHOWDRY V K, LUO Y, WIDEN F, et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with a lateral flow dipstick for rapid and simple detection of classical swine fever virus in the field[J]. Journal of virological methods, 2014,197﹕14-18.

[24] 何文博. 豬瘟強(qiáng)毒株與兔化弱毒疫苗株的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鑒別檢測(cè)[D].鄭州大學(xué),2014.

[25] 張改平,何文博,王德國(guó),等.豬瘟強(qiáng)毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測(cè)[J].鄭州：鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2014,46 (3)﹕85-90.

[26] 朱俊靈,葉佐東,鄧潔汝,等.豬瘟病毒RT-LAMP-LFD檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016，37（1）﹕1-7.

2017-05-04）

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目資助(黔科合NY字[2014]3055 號(hào))；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目資助(黔科合J 字[2013]2110 號(hào))。

石遠(yuǎn)菊（1993-），女，貴州福泉人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子病毒學(xué)的科研學(xué)習(xí)。

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E-mail:tdyuan@163.com.