王 芳，原文霞，鮑根良，錢長(zhǎng)根，黃 堅(jiān)，劉 健，楊 勇，嚴(yán)成其，陳劍平*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040； 2.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 嘉興 314000;3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

藥用野生稻胚拯救后代YF2快繁技術(shù)

王 芳1，原文霞3，鮑根良3，錢長(zhǎng)根2，黃 堅(jiān)1，劉 健1，楊 勇3，嚴(yán)成其3，陳劍平3*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040； 2.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 嘉興 314000;3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

取藥用野生稻胚拯救后代的幼芽1～2 cm，經(jīng)70%酒精消毒30 s，0.1%升汞搖動(dòng)消毒8 min及無(wú)菌水洗3～5次后，將其放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1中培養(yǎng)，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率為31%；然后轉(zhuǎn)入MS+IAA 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 2.0～4.0 mg·L-1+KT 1.0～2.0 mg·L-1分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成苗率為62%。成苗后轉(zhuǎn)入1/2 MS+IAA 0.02～0.5 mg·L-1生根培養(yǎng)基中，生根率達(dá)到99%。煉苗7 d后移栽到苗床，成活率達(dá)到90%。短期內(nèi)可實(shí)現(xiàn)胚拯救后代YF2組培苗健康及快繁生長(zhǎng)，為創(chuàng)制水稻新種質(zhì)和研究抗病蟲新基因克隆和利用奠定基礎(chǔ)。

藥用野生稻； 胚拯救； 組織培養(yǎng)； 快繁

野生稻是一種寶貴的自然資源，它含有栽培稻所沒(méi)有的或已經(jīng)丟失的豐富的優(yōu)異基因，藥用野生稻是我國(guó)現(xiàn)存的3種野生稻之一，前期研究結(jié)果表明，藥用野生稻對(duì)灰飛虱具有很強(qiáng)的抗性和排驅(qū)性[1-4]。由于藥用野生稻和普通栽培稻分屬不同物種，藥用野生稻染色體組CC型，栽培稻染色體組AA型，用常規(guī)的有性雜交方法不結(jié)實(shí)[5]。為了充分利用藥用野生稻資源，課題組采用藥用野生稻和栽培稻通過(guò)胚拯救技術(shù)獲得了胚拯救后代YF2，實(shí)現(xiàn)藥用野生稻的遺傳物質(zhì)向栽培稻轉(zhuǎn)移。為挖掘具有自主產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆、養(yǎng)分高效等重要優(yōu)良品種資源奠定基礎(chǔ)[6-8]。

但是在具體的研究中缺少遺傳背景一致的藥用野生稻胚拯救后代，難以進(jìn)行抗性基因的研究和新種質(zhì)的育種利用，組培快繁技術(shù)增殖速度快，生產(chǎn)周期短，繁殖系數(shù)高，可在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)遺傳性一致的藥用野生稻胚拯救后代規(guī)?；a(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥用野生稻胚拯救后代YF2來(lái)源于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所溫室。

1.2 方法

1.2.1 材料的采集與消毒

取藥用野生稻胚拯救后代YF2幼芽1～2 cm，經(jīng)70%乙醇消毒30 s，0.1%氯化汞加1滴，搖動(dòng)消毒8 min，然后無(wú)菌水洗3～5次。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性細(xì)胞的形成

取消毒后的藥用野生稻胚拯救后代YF2幼芽，剪成0.1～0.2 mm，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。通常每隔3周挑選胚性愈傷組織或質(zhì)量好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)、誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基均為MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1，在(25±2)℃暗培養(yǎng)。適量增加糖、瓊脂的濃度，并添加谷氨酰胺。部分非胚性愈傷組織能誘導(dǎo)胚性愈傷組織。

1.2.3 胚性細(xì)胞分化成小苗

將誘導(dǎo)出的胚性細(xì)胞接種在MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 2.0～4.0 mg·L-1+KT 1.0～2.0 mg·L-1分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光強(qiáng)2 000～3 000 lx，光照16 h·d-1。

1.2.4 生根培養(yǎng)

將小苗接種于1/2 MS+IAA 0.3～1.0 mg·L-1培養(yǎng)基，置于25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間16 h·d-1的環(huán)境中培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)植株高度、葉片數(shù)、根數(shù)等生長(zhǎng)情況。

1.2.5 煉苗及移栽

待小苗在培養(yǎng)基中長(zhǎng)至10 cm后，直接打開培養(yǎng)瓶蓋，加入少量純凈水，水量以高過(guò)培養(yǎng)基2 cm為宜，定時(shí)觀察續(xù)水；7 d后用溫水將小苗充分洗凈，然后置于內(nèi)含10 mL 1/2 MS+0.3 mg·L-1IAA水溶液的三角瓶中，7 d后移栽到苗床。苗床要求：移栽前充分泡水保證有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀養(yǎng)分充足。移栽后覆膜保濕，7 d內(nèi)每天中午揭膜透氣，后期可逐步揭開，15 d后移栽至大田。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性細(xì)胞的形成

將剪成0.1～0.2 mm的藥用野生稻胚拯救后代接種到MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1個(gè)月后不同程度地誘導(dǎo)出愈傷組織，初次誘導(dǎo)出的愈傷組織，有些是非胚性的。若繼代培養(yǎng)基中糖和瓊脂的濃度分別超過(guò)35、9 g·L-1，同時(shí)添加350 mg·L-1谷氨酰胺，能使部分愈傷組織轉(zhuǎn)變成小顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織。

在同一培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月左右能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)可建成分散性好、色澤鮮黃、細(xì)胞質(zhì)濃、具有旺盛分裂能力的胚性細(xì)胞。其中，最佳誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的配方是MS+2.5 mg·L-12, 4-D+0.3 mg·L-16-BA，誘導(dǎo)率達(dá)到31%。

2.2 不同激素濃度對(duì)胚拯救后代胚性細(xì)胞再生苗的影響

設(shè)10組含有不同濃度激素的MS培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基接50個(gè)胚性細(xì)胞，60 d后觀察結(jié)果(表1)。結(jié)果表明，MS+0.5～4.0 mg·L-1IAA+0.5～4.0 mg·L-16-BA+0.5～2.6 mg·L-1KT均可誘導(dǎo)成苗，成苗率達(dá)到4%～62%，其中最佳培養(yǎng)基配方為MS+3.0 mg·L-1IAA+3.0 mg·L-16 BA+2.0 mg·L-1KT，其成苗率可達(dá)62%。

2.3 生根培養(yǎng)

將再生的小苗接種至1/2 MS+1.0～3.0 mg·L-1IAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均能長(zhǎng)出根莖葉完整的水稻植株，30 d后生根率達(dá)到99%，但是生長(zhǎng)在1/2 MS+1.0 mg·L-1IAA培養(yǎng)基的水稻再生植株徒長(zhǎng)，最佳的生根培養(yǎng)基應(yīng)該是1/2 MS+3.0 mg·L-1IAA。

2.4 煉苗及移栽

由于組培苗在形態(tài)和生理結(jié)構(gòu)上與自然生長(zhǎng)苗存在一定差異，為了適應(yīng)移栽后的自然環(huán)境，需要由異養(yǎng)逐步過(guò)渡到自養(yǎng)，生長(zhǎng)環(huán)境由無(wú)菌變?yōu)橛芯瑴毓鈼l件也發(fā)生顯著變化。

研究表明，煉苗7 d后，10～15 cm的再生小植株直接移栽到保持濕度的苗床中，1周后成活率達(dá)90%。

3 小結(jié)與討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響水稻愈傷組織誘導(dǎo)和胚性細(xì)胞形成的關(guān)鍵因素之一，2, 4-D是誘導(dǎo)水稻組織產(chǎn)生愈傷組織不可缺少的關(guān)鍵激素成分。但是，當(dāng)2, 4-D濃度大于4 mg·L-1或小于1 mg·L-1時(shí)都不利于水稻拯救后代愈傷和胚性細(xì)胞的形成。已建成的胚性細(xì)胞，繼代時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，胚性會(huì)減弱，表現(xiàn)為部分細(xì)胞團(tuán)開始解體，細(xì)胞團(tuán)周邊細(xì)胞的表面變得粗糙，出現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀突起，甚至有非胚性的細(xì)胞。初次誘導(dǎo)出的愈傷組織，有些是非胚性的，若繼代培養(yǎng)基中糖、瓊脂的濃度大于35和10 g·L-1，同時(shí)添加350 mg·L-1谷氨酰胺，能使愈傷組織轉(zhuǎn)變成小顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織。愈傷組織的色澤、外表對(duì)再生頻率有影響，一般色澤淺白、花菜形狀、結(jié)構(gòu)緊密的胚性愈傷組織容易變綠，長(zhǎng)出綠芽。小植株在移栽之前必須經(jīng)過(guò)煉苗，苗床煉苗時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則組培苗生長(zhǎng)過(guò)大、根系過(guò)長(zhǎng)，移栽至大田時(shí)容易構(gòu)成二次損傷。

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(責(zé)任編輯：侯春曉)

2017-01-20

浙江省自然科學(xué)基金(2014C140001)；浙江省重大攻關(guān)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗水稻新品種選育項(xiàng)目(2012C12901-2)；寧波市重大科技項(xiàng)目(2016C11017)

王 芳(1981—)，女，浙江寧波人，農(nóng)藝師，從事良種生物育種與推廣工作，E-mail: wangfang811028@163.com。

陳劍平，研究員，博士，E-mail: jpchen2001@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170430

S511

B

0528-9017(2017)04-0642-02

文獻(xiàn)著錄格式：王芳，原文霞，鮑根良，等. 藥用野生稻胚拯救后代YF2快繁技術(shù)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(4)：642-643，647.