陳國強(qiáng)，唐泰山，王凱民，姜 焱，陳 雷，張 睿，張常印，袁 飛

（1.蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇蘇州 215021；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南京 210001；3. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京 100176）

進(jìn)口牛在出口隔離場免疫牛病毒性腹瀉疫苗對(duì)后續(xù)檢疫工作的影響及應(yīng)對(duì)策略

陳國強(qiáng)1，2，唐泰山1，王凱民2，姜 焱2，陳 雷2，張 睿2，張常印2，袁 飛3

（1.蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇蘇州 215021；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南京 210001；3. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京 100176）

本文分析了進(jìn)境種牛在境外出口隔離場免疫牛病毒性腹瀉滅活疫苗后，對(duì)該病后續(xù)檢疫工作的影響：從血清樣品中進(jìn)行病毒分離會(huì)受到干擾；對(duì)出口隔離場檢疫所用的抗原捕捉ELISA幾乎沒有影響；對(duì)種牛在國內(nèi)進(jìn)口隔離場檢疫及后續(xù)檢疫時(shí)，如使用針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白Erns的抗原捕捉ELISA試劑盒，則影響較小，如使用針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白的NS2-3 抗原捕捉ELISA試劑盒，則影響很大；免疫導(dǎo)致無法區(qū)分自然感染和免疫反應(yīng)。進(jìn)而提出了取消免疫該疫苗的建議，并得到了進(jìn)出口國政府主管部門的認(rèn)同并付諸實(shí)施。

進(jìn)口；牛；免疫；牛病毒性腹瀉病毒；疫苗；影響

自2000年以來，尤其是2008年的“三聚氰胺”事件以后，我國大量從澳大利亞、新西蘭進(jìn)口奶牛。我國從澳大利亞輸入牛的檢疫和衛(wèi)生要求議定書[1]規(guī)定，從澳大利亞進(jìn)口種牛，須對(duì)下列7種傳染病進(jìn)行檢疫：牛傳染性鼻氣管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）、赤羽病、牛病毒性腹瀉（Bovine Viral Diarrhea，BVD）、牛地方流行性白血病、藍(lán)舌病、副結(jié)核、鹿流行性出血熱。我國從新西蘭輸入牛的檢疫和衛(wèi)生要求議定書[2]規(guī)定，從新西蘭進(jìn)口種牛須對(duì)下列5種傳染病病進(jìn)行檢疫：IBR、BVD、牛地方流行性白血病、牛結(jié)核病、副結(jié)核。為方便國際貿(mào)易，我國從澳大利亞和新西蘭輸入牛的檢疫和衛(wèi)生要求議定書（均為現(xiàn)行的2009年版）規(guī)定，IBR農(nóng)場檢疫為陰性的牛，在進(jìn)隔離場檢疫前接種滅活疫苗，并在所有牛進(jìn)入隔離場至少14 d后，使用滅活疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫。當(dāng)時(shí)，澳大利亞唯一被批準(zhǔn)使用的IBR滅活疫苗是美國FORT DOGE 公司生產(chǎn)的Triangle?4+Type‖BVD疫苗，含有滅活的牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV）、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）、副流感3型病毒（Parainf l uenza 3 Virus，PI3V）和牛呼吸道合胞體病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）；新西蘭使用的是西班牙LABORATORIOS HIPRA 公司生產(chǎn)的IBRV、PI3V和BVD三聯(lián)滅活苗。因此，我國從澳大利亞和新西蘭進(jìn)口牛時(shí)，澳方和新方在接種IBR疫苗時(shí)，實(shí)際上還同時(shí)接種了BVD、PI3V和RSV等疫苗。文獻(xiàn)[3]提出了以接種能區(qū)分免疫和自然感染的牛皰疹病毒Ⅰ型基因缺失疫苗來代替接種滅活疫苗為主要內(nèi)容的新建議。本文針對(duì)境外接種BVD疫苗后不可避免產(chǎn)生的抗體，對(duì)進(jìn)境種牛的產(chǎn)地檢疫、在國內(nèi)隔離場的隔離檢疫以及隔離期滿后的后續(xù)檢疫將產(chǎn)生哪些影響及應(yīng)對(duì)策略，進(jìn)行了全面分析。

1 從血清樣品中進(jìn)行病毒分離會(huì)受到干擾

根據(jù)議定書要求，BVDV檢測方法為病毒分離或抗原捕捉ELISA（antigen capture ELISA，ACELISA）。通過母乳獲得的母源抗體不能改變犢牛的病毒血癥狀態(tài)，但會(huì)干擾BVDV在細(xì)胞系中的生長，從而干擾從血清中分離病毒。免疫產(chǎn)生的抗體也一樣[3]。免疫后，尤其是加強(qiáng)免疫后，會(huì)導(dǎo)致BVD抗體水平較高，因而從血清樣品中分離病毒會(huì)受到干擾。因此，建議不要采用從血清樣品中分離病毒的檢測方法[4]。在澳洲隔離場和國內(nèi)隔離場的常規(guī)檢疫，目前一般不采用從血清樣品中分離病毒的檢測方法。建議對(duì)進(jìn)口隔離場檢疫期內(nèi)發(fā)病和死亡病例及進(jìn)口隔離場檢疫結(jié)束后進(jìn)行的BVDV檢測時(shí)，也不要采用從血清樣品中分離BVDV的檢測方法。

2 對(duì)國外出口隔離場的AC-ELISA檢疫幾乎沒有影響

由于使用血清樣品的便利性，在國外出口隔離場，目前一般都采用AC-ELISA方法從血清樣品中檢測BVDV。免疫滅活疫苗后對(duì)其有無影響呢？AC-ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)在于擁有與病毒分離相近的敏感性。目前有兩類AC-ELISA試劑盒：一種是檢測非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3（p125）的AC-ELISA試劑盒；另外一種是近幾年研發(fā)出的檢測結(jié)構(gòu)蛋白Erns（gp48）的新一代AC-ELISA試劑盒[4-5]。

由于BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3的表達(dá)量低，因此NS2-3 AC-ELISA試劑盒只適用于BVDV濃度高的外周血白細(xì)胞裂解物中的BVDV抗原檢測，不而能用于BVDV濃度低的血液、血漿或血清樣品中的BVDV抗原檢測。另外，由于BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3的表達(dá)量本身就低，如果樣品中還存在BVDV母源抗體等抗體的干擾，那么BVDV NS2-3 AC-ELISA的效果就更差。因此，試劑盒廠家明確表示NS2-3 AC-ELISA不能用于6月齡以下犢牛的檢測[4-5]。

BVDV結(jié)構(gòu)蛋白Erns（gp48）含量高且穩(wěn)定，因此ErnsAC-ELISA試劑盒，既能檢測血液中的BVDV抗原，也能檢測血漿或血清樣品中的BVDV抗原。甚至血清樣品中存在一定滴度的BVDV抗體時(shí)，BVDV ErnsAC-ELISA也是敏感和可靠的[4-6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，BVDV ErnsAC-ELISA試劑盒能檢出100%（14/14）母源抗體滴度小于1∶10的持續(xù)感染動(dòng)物，能檢出75%（3/4）母源抗體滴度為1∶250的持續(xù)感染動(dòng)物。對(duì)接種BVDV滅活疫苗后能正常產(chǎn)生抗體的牛群，由于只經(jīng)歷了首免，因此抗體滴度很低，甚至可能低于可檢測的水平[5]。

綜上，在進(jìn)行BVDV滅活疫苗首次免疫后20 d，在國外出口隔離場采集血清樣品進(jìn)BVDV抗原檢測時(shí)，如果使用BVDV NS2-3 AC-ELISA試劑盒，影響就很小；如果使用BVDV ErnsAC-ELISA試劑盒，幾乎就沒有影響。但為了避免出現(xiàn)假陰性，應(yīng)優(yōu)先選用BVDV ErnsAC-ELISA試劑盒。

3 對(duì)國內(nèi)進(jìn)口隔離場及后續(xù)檢疫所用的Erns AC-ELISA影響較小，但對(duì)NS2-3 AC-ELISA影響很大

對(duì)于BVDV滅活疫苗免疫抗體的檢測，可用中和試驗(yàn)或ELISAS檢測。有文獻(xiàn)報(bào)道，將BVDV人工接種于抗體滴度達(dá)到1∶512的動(dòng)物，也分離不到BVDV[5]。由于BVDV滅活疫苗產(chǎn)生的抗體對(duì)BVDV NS2-3 AC-ELISA試劑盒的干擾較大，而對(duì)BVDV ErnsAC- ELISA試劑盒的干擾很小，因此為了降低BVDV檢測的假陰性率，國內(nèi)隔離場在現(xiàn)場檢疫及后續(xù)檢疫時(shí)，只能使用BVDV ErnsAC-ELISA試劑盒，而不能使用BVDV NS2-3 ACELISA試劑盒。

4 免疫導(dǎo)致無法區(qū)分自然感染和滅活苗免疫反應(yīng)

免疫BVDV滅活疫苗后是否導(dǎo)致不能區(qū)分自然感染和滅活苗免疫反應(yīng)呢？中和試驗(yàn)和牛病毒性腹瀉總抗體試劑盒可以檢出自然感染和弱毒疫苗、滅活疫苗的抗體[6]。此外，還有檢測 BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白 NS2-3（或稱gp80）抗體的競爭ELISA抗體檢測試劑盒。

Rudiger Raue 2011年報(bào)道，使用2種總抗體試劑盒和7種不同的NS2-3（gp80）抗體試劑盒，去檢測接種4種商業(yè)化BVDV滅活疫苗后的免疫反應(yīng)，以檢測是否能區(qū)分自然感染和免疫反應(yīng)。但結(jié)果顯示，所有的NS2-3（或稱gp80）抗體試劑盒和滅活疫苗的組合只在群體水平上區(qū)分免疫和自然感染有一定的意義，都不能在個(gè)體水平上區(qū)分免疫和自然感染。要區(qū)分免疫和自然感染，需待真正標(biāo)記疫苗的出現(xiàn)[8]。

可見，現(xiàn)有BVDV疫苗的免疫將導(dǎo)致無法區(qū)分自然感染和免疫反應(yīng)。

5 結(jié)論和建議

綜上分析，在境外出口隔離場免疫BVD滅活疫苗后，對(duì)后續(xù)檢疫工作帶來較大不利影響，尤其是導(dǎo)致無法區(qū)分自然感染和免疫反應(yīng)，因此建議進(jìn)境種牛在境外出口隔離場不允許免疫包含BVDV的疫苗。該建議得到了國家質(zhì)檢總局、澳大利亞動(dòng)植物檢驗(yàn)局和新西蘭初級(jí)產(chǎn)業(yè)部等進(jìn)出口國主管部門認(rèn)同并付諸實(shí)施。

近年來澳大利亞COOPER動(dòng)物保健公司新推出了BOVILIS MH+IBR滅活苗。該疫苗是溶血性曼氏桿菌和IBR的雙聯(lián)滅活苗。澳方用該雙聯(lián)苗取代原先所使用的四聯(lián)苗，由此大大降低了負(fù)面影響。新西蘭使用的是Biobos IBR 標(biāo)記疫苗。該疫苗是只含有滅活I(lǐng)BRV的單苗，徹底避免了其它疫苗的負(fù)面影響。而且這是一種基因缺失疫苗，可以區(qū)分自然感染和免疫反應(yīng)。以接種能區(qū)分免疫和自然感染的基因缺失疫苗來代替接種滅活疫苗的建議，已率先在新西蘭出口奶牛中得到實(shí)現(xiàn)[3]。

[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 中國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局與澳大利亞農(nóng)魚林業(yè)部關(guān)于中國從澳大利亞輸入牛的檢疫和衛(wèi)生要求議定書[EB/OL].（20160617）[201-07-10]. http∶//www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/ywxx/dzwjy/201506/t20150617_442783.htm.

[2] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 中國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局與新西蘭農(nóng)林部關(guān)于中國從新西蘭輸入牛的檢疫和衛(wèi)生要求議定書[EB/OL].（20160617）[201-07-10].http∶//www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/ywxx/dzwjy/201506/t20150617_442783.htm.

[3] 陳國強(qiáng)，張睿，陳雷. 對(duì)從大洋洲進(jìn)口牛的皰疹病毒Ⅰ型五種檢疫方案的評(píng)估[J]. 中國動(dòng)物檢疫，2014，31（12）：61-64.

[4] OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals（2015）CHAPTER 2.4.5[EB/OL]. [201-07-10].http∶//www.oie.int/en/international-standard-setting/terrestrialmanual/access-online/.

[5] GREGO E，USLENGHI F，STRASSER M，et al. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine viral diarrhea antibody based on Ernsglycoprotein expressed in a baculovirus system [J]. Journal of veterinary diagnostic investigation，2007，19（1）：21-27.

[6] TODD E C，ALBERTO L，Van O，et al. Comparison of ear notch immunohistochemistry，ear notch antigen-capture ELISA，and buffy coat virus isolation for detection of calves persistently infected with bovine viral diarrhea virus [J]. Journal of veterinary diagnostic investigation，2005，17：110-117.

[7] RAUE R，HARMEYER S S，NANJIANI I A. Antibody responses to inactivated vaccines and natural infection in cattle using bovine viral diarrhoea virus ELISA kits：assessment of potential to differentiate infected and vaccinated animals [J].Veterinary journal，2011，187（3）：330-334.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Effects on Subsequent Quarantine of Imported Cattle Vaccinated with Bovine Virus Diarrhea Vaccine in Pre-export Isolation Facilities and Countermeasures

Chen Guoqiang1，2，Tang Taishan1，Wang Kaimin2，Jiang Yan2，Chen Lei2，Zhang Rui2，Zhang Changyin2，Yuan Fei3
（1. Suzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Suzhou，Jiangsu 215021；2. Jiangsu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing，Jiangsu 210001；3. Food Safety Research Institute，China Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176）

After breeding cattle imported into China vaccinated with vaccines containing inactivated Bovine viral diarrhea virus（BVDV）in pre-export isolation facilities，it would bring subsequent effects in quarantine. In this paper，the inf l uence of follow-up quarantine work for this disease were analyzed as followed：BVDV isolation from serum samples was disturbed；There was ignorable effects for BVDV detection with antigen capture ELISA in preexport isolation facilities；For cattle quarantine at the domestic quarantine and subsequent quarantine inspection in China，ErnsAC-ELISA was much better than NS2-3 AC-ELISA for BVDV detection；Antibody responses to BVDV vaccines couldn't be distinguished from response of natural infection. The proposal of cancelling vaccination of BVDV should be canceled were put forward，and was accepted by the authorities of import and export countries.

import；cattle；Bovine viral diarrhea virus；vaccine；effect

S851.34

A

1005-944X（2017）11-0029-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.008

質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目（2013IK034）；廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（IQTC201602）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201510038）