丁香瑩 梁敏

1．廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530021

2．廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西南寧530021

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是臨床最常用的藥物之一，由于具有良好的抗炎、抗毒、抗休克和免疫抑制作用，廣泛用于風(fēng)濕性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚病及腎臟病等疾病的治療［1］。然而長期應(yīng)用GC會(huì)導(dǎo)致許多并發(fā)癥，包括骨質(zhì)疏松癥、骨壞死、代謝綜合癥、心血管疾病、感染、白內(nèi)障等［2］，其中所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥，稱之為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松 癥 (glucocorticoid-induced Osteoporosis，GIOP)［3］，是GC最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。GIOP是20～45歲人群骨質(zhì)疏松癥最常見的原因。GC治療數(shù)星期后即開始出現(xiàn)骨量丟失，在最初的3個(gè)月內(nèi)骨量丟失速度最快，之后為持續(xù)的骨量丟失，1年后骨量丟失速度減慢。在國外一項(xiàng)大樣本的人群調(diào)查中發(fā)現(xiàn)平均0.75%的人長期口服 GC治療［4］，超過40%的使用GC的人群發(fā)生了骨量丟失［5］。GIOP的發(fā)生與激素的劑量密切相關(guān)，大劑量和長時(shí)間的激素治療更容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松和骨折。但是，即使使用小劑量的GC也會(huì)出現(xiàn)GIOP。如每日服用2.5 mg強(qiáng)的松也可能發(fā)生椎骨和髖關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松性骨折［6，7］。GIOP引起的骨折嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，致殘率和致死率高。因此，目前GIOP已成為全世界面臨的嚴(yán)峻公共衛(wèi)生問題，危害巨大［8］。

1 細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)與檢測(cè)

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生理性的死亡，凋亡對(duì)組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要的作用。1972年，Kerr等［9］首次提出了“細(xì)胞凋亡(apoptosis)”的概念，細(xì)胞凋亡具有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和生化特征，包括細(xì)胞收縮、細(xì)胞膜外滲、染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞核DNA降解［10］。凋亡的異常與許多的疾病密切相關(guān)［11］，如癌癥、老年性癡呆［12］等。目前有多種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，隨著細(xì)胞凋亡研究的深入，新的檢測(cè)方法也被不斷地開發(fā)出來。

1.1 形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法

1.1.1 普通光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡:光鏡下可以識(shí)別細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生的形態(tài)變化。采用普通倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡是一個(gè)較為快速和廉價(jià)的方法，但檢測(cè)缺乏客觀性，只能觀察到大體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，較難與細(xì)胞壞死區(qū)分開來。電子顯微鏡分透射電鏡和掃描電鏡兩種。一般采用透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡，透射電鏡是觀察細(xì)胞凋亡最經(jīng)典和最可靠的方法［13］。采用電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡可以提供足量的信息，對(duì)后續(xù)生化或分子研究有一定的幫助。但是標(biāo)本的制作需要耗費(fèi)較長的時(shí)間(透射電鏡需5～6 d，掃描電鏡需要24 h)，透射電鏡分析只能對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性，對(duì)細(xì)胞凋亡程度的定量分析困難。

1.1.2 熒光顯微鏡:在熒光顯微鏡下凋亡細(xì)胞核的特征性形態(tài)可被清晰地辨認(rèn)，正常細(xì)胞的細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)的是黃綠色熒光并且分布均勻，細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)橘紅色熒光，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染色質(zhì)染色呈黃綠色熒光且濃聚在核膜內(nèi)側(cè)。熒光顯微鏡技術(shù)是良好的凋亡檢測(cè)手段，但是對(duì)于細(xì)胞凋亡的早期，熒光顯微鏡很難分辨。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)

1.2.1 Annexin V-FITC/PI雙染法:細(xì)胞凋亡的最早跡象之一是細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸從質(zhì)膜的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜的外層［14］。膜聯(lián)蛋白V以鈣依賴性的方式結(jié)合這些暴露于膜外磷脂酰絲氨酸，它通常與重要的染料一起使用，例如與核酸結(jié)合的7氨基放線菌素D(7-amino-actinomysin D，7-ADD)或碘化丙啶(propidium lodide，PI)，但PI只有當(dāng)膜完整性被破壞時(shí)才能滲透到質(zhì)膜，如在細(xì)胞凋亡或壞死的后期階段。Annexin V-FITC/PI雙染法可用于細(xì)胞凋亡的早期檢測(cè)，也可用于細(xì)胞凋亡的定量和定性研究。但干擾因素多，尤其在處理細(xì)胞的過程中很容易產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果。

1.2.2 線粒體膜電位的檢測(cè):線粒體是細(xì)胞中產(chǎn)生ATP的主要場(chǎng)所，在凋亡發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，線粒體膜電位變化發(fā)生在核酸酶激活和明顯的形態(tài)變化之前。線粒體膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中最早發(fā)生的事件，一旦線粒體膜電位發(fā)生變化，細(xì)胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)［15］。因此通過檢測(cè)線粒體膜電位變化可以進(jìn)行細(xì)胞凋亡的早期檢測(cè)。

1.3 DNA片段化的分子生物學(xué)檢測(cè)

在凋亡進(jìn)行的過程中，DNA降解要早于典型的形態(tài)學(xué)改變，因此DNA分子水平的檢測(cè)對(duì)發(fā)現(xiàn)凋亡有較高的價(jià)值。細(xì)胞凋亡最明顯的生化特點(diǎn)是激活內(nèi)源性核酸酶，將核染色體的核小體分解形成寡核苷酸片段，大小約180～200bp［14］。主要的檢測(cè)方法有瓊脂糖凝膠電泳法(DNA Ladder)和原位切口末端標(biāo)記法(TUNEL)。這些方法具有較高的特異性和靈敏度，為細(xì)胞凋亡提供了強(qiáng)大的工具和檢測(cè)手段。

1.3.1 TUNEL法:1992年由Gavrieli首次提出了脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)方法［16］。TUNEL法是基于細(xì)胞凋亡中斷裂的DNA鏈會(huì)產(chǎn)生大量的3＇-OH末端，利用脫氧核糖核甘酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)將標(biāo)記的dUTP連接到3＇-OH末端［17］。因?yàn)檎＜?xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，沒有 3＇-0H 末端產(chǎn)生，故很少染色，因此TUNEL法具有極高的靈敏度，可用于單個(gè)細(xì)胞的檢測(cè);還可以進(jìn)行定量分析，被廣泛應(yīng)用于組織切片中。但是TUNEL方法缺乏專一性。

1.3.2 DNA Ladder法:細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)激活核酸內(nèi)切酶，DNA被分解為180～200 bp整數(shù)倍的小片段，在瓊脂糖凝膠電泳中表現(xiàn)為梯狀條帶，這是凋亡特異性結(jié)果。正?；罴?xì)胞DNA條帶位于加樣孔附近的區(qū)帶，壞死細(xì)胞的DNA由于不規(guī)則降解顯示出一條連續(xù)的膜狀條帶。采用這種方法快速簡(jiǎn)便易行，但特異性和敏感性較差，只能進(jìn)行定性分析［18］。

細(xì)胞凋亡的研究需要定性和定量研究，常需要結(jié)合多種方法?？筛鶕?jù)標(biāo)本的不同和研究的需要選擇不同的研究方法。

2 GC對(duì)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡的影響

2.1 GIOP與成骨細(xì)胞凋亡的關(guān)系

對(duì)大約42000名男子和婦女的7項(xiàng)隊(duì)列研究數(shù)據(jù)進(jìn)行的Meta分析表明，使用GC會(huì)增加任何年齡的腰椎骨折的風(fēng)險(xiǎn)［19］。臨床研究［20］發(fā)現(xiàn)，GIOP 患者的骨組織中成骨細(xì)胞數(shù)目減少，成骨細(xì)胞的凋亡率增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［21］也證實(shí)，小鼠服用強(qiáng)的松后，椎骨骨密度降低;組織形態(tài)學(xué)顯示骨小梁面積減少，成骨細(xì)胞集落形成單位減少，成骨細(xì)胞的凋亡數(shù)目增長3倍，干骺端的皮質(zhì)骨28%的骨細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。提示應(yīng)用GC后，無論人體和動(dòng)物發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)增加，與成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。

2.2 GC導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡可能的通路

成骨細(xì)胞作為GC主要的作用靶點(diǎn)，在GIOP發(fā)病中起著重要的作用，GC主要通過與 GC受體(glucocorticoid receptor，GR)結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)作用［22］，研 究［23］發(fā)現(xiàn)，GR的拮抗劑米非司酮(RU486)，能夠抑制地塞米松導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道，GC能夠增加 BH3-only蛋白Bim的表達(dá)［24］以及下調(diào) TIMP-1［25］來促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。在體外實(shí)驗(yàn)中，過量的GC能夠誘導(dǎo)前凋亡因子Bim和Bak表達(dá)，降低存活因子 Bcl-xL 表達(dá)［24，26］。過量的 GC 通過促進(jìn) Ca2+流出來激活pyk2，活化的pyk2誘導(dǎo)JNK活化，隨后引起細(xì)胞凋亡［27］。過量的GC增加了活性氧(ROS)的產(chǎn)生，活性氧(ROS)能夠通過PKCβ/p66shc/JNK通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)過量的GC抑制了Akt，從而抑制了骨形成和防止細(xì)胞凋亡所必需的Wnt/βcatenin通路［28］。Wnt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞生成和骨代謝方面具有重要作用，Wnt信號(hào)通路促使成骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡［29，30］。高劑量的GC抑制Wnt信號(hào)通路，引起成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外培養(yǎng)原代C57BL/6細(xì)胞中，GC增加了Wnt通路抑制劑(硬化蛋白和Dkk-1)的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡［31］，在沉默Dkk-1表達(dá)后能夠恢復(fù)地塞米松促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用［32］。

2.3 GC導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡與caspase家族

天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶(caspases)是一組在凋亡中發(fā)揮重要作用的蛋白酶。caspases在凋亡信號(hào)作用下發(fā)生逐級(jí)水解活化，最后裂解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，使細(xì)胞降解引起凋亡，caspases活化是導(dǎo)致凋亡的中心環(huán)節(jié)。有研究［33，34］發(fā)現(xiàn) GC 通過激活 caspase-3的活性來誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。采用1 μmol/L地塞米松干預(yù)成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞，明顯增加活化caspase-3的表達(dá)［35］。在我們本課題組研究不同濃度地塞米松干預(yù)成骨細(xì)胞不同時(shí)間后成骨發(fā)生凋亡相比對(duì)照組明顯增加，呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)caspase-3和caspase-9的基因表達(dá)增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性。表明GC導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡與caspase家族密切相關(guān)，GC可能是通過激活caspase的活性來誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

2.4 GC導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡的其他靶點(diǎn)

GC還能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，磷酸化的eIF2a能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，應(yīng)用磷酸化的eIF2a能夠抑制GC通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生［36］。研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(TAK1)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞系和骨細(xì)胞的凋亡，應(yīng)用TAK1抑制劑后，能夠阻斷地塞米松所致的成骨細(xì)胞凋亡［37］。

綜上所述，成骨細(xì)胞是GC作用的主要靶點(diǎn)，GC通過各種機(jī)制誘導(dǎo)和促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致GIOP的發(fā)生。由此可見，細(xì)胞凋亡在GIOP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了極其重要的作用。

3 糖皮質(zhì)激素促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因

細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格的調(diào)控，具有十分復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，參與的分子和酶也非常多，細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和發(fā)展需要許多基因及其產(chǎn)物參與。參與GIOP中成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡的基因主要有B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)基因家族、p53基因、Fas和FasL基因等。

3.1 Bcl-2基因家族

Bcl-2基因家族有眾多成員，如:Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w、Bax、Bak、Bad、Bim、Mcl-1、A1 等。Bcl-2 家族在GIOP中扮演重要的角色［24］，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bax/Bcl-2的比率的高低決定了細(xì)胞凋亡是否發(fā)生。用1 mg/kg的地塞米松處理小鼠72 h，TUNEL染色顯示小鼠成骨細(xì)胞的凋亡率比對(duì)照組增加了8倍，實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞的Bcl-2水平下降，Bax水平升高，Bax/Bcl-2比率上升，提示地塞米松通過升高Bax/Bcl-2比率來促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［38］。

3.2 p53基因

p53基因是一種重要的抑癌基因，調(diào)控著細(xì)胞生長、分化及死亡各方面。近年來研究［39］表明，p53基因在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中亦有重要作用。研究［35］發(fā)現(xiàn)，地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡與p53基因異常激活有關(guān)，觀察地塞米松對(duì)小鼠成骨細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞凋亡伴隨著p53基因和促凋亡基因Noxa和Puma的表達(dá)增加而增加。當(dāng)p53受到p53 RNA干擾時(shí)，地塞米松就不能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。

3.3 Fas和FasL基因

Fas又稱為CD95分子，F(xiàn)as與其配體Fas L相互作用是引起細(xì)胞凋亡的主要途徑之一［40］。大多數(shù)的組織和細(xì)胞都有Fas的表達(dá)。Fas L為TNF相關(guān)的Ⅱ型膜分子。有研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡可能與Fas/CD95死亡受體有關(guān)，應(yīng)用Fas信號(hào)通路的上游caspase-8的抑制劑后，能夠阻斷地塞米松所致的成骨細(xì)胞凋亡［41］。

4 結(jié)語

GC是臨床上治療多種疾病的常用藥物，其中以地塞米松應(yīng)用得最為廣泛。在采用GC治療疾病的同時(shí)也導(dǎo)致了繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。GC主要是通過增加成骨細(xì)胞凋亡，引起成骨細(xì)胞的數(shù)量減少，導(dǎo)致了GIOP的發(fā)生。因此對(duì)于需要使用GC治療的患者，可以使用增加骨形成的藥物，如特立帕肽來防治GIOP。由于特立帕肽存在價(jià)格昂貴，需要每天注射，有增加骨肉瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)等缺陷，因此，有可能通過開發(fā)抑制成骨細(xì)胞凋亡的藥物來防治GIOP，為臨床防治GIOP等代謝性骨病提供更好的手段。