馬紀(jì)

（黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

脫毒馬鈴薯試管微型薯繁育技術(shù)

馬紀(jì)

（黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

馬鈴薯受到病毒的感染后會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象，進(jìn)而降低馬鈴薯的產(chǎn)量。通過對(duì)馬鈴薯進(jìn)行脫毒，并使用試管微型薯繁殖技術(shù)培養(yǎng)無(wú)毒的馬鈴薯種子，可大大提高馬鈴薯的產(chǎn)量，保證馬鈴薯的品質(zhì)。本文對(duì)馬鈴薯脫毒技術(shù)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，明確脫毒馬鈴薯試管微型薯繁殖技術(shù)要點(diǎn)，并對(duì)馬鈴薯繁殖技術(shù)中病毒檢測(cè)方法進(jìn)行了討論，以期促進(jìn)脫毒馬鈴薯試管微型薯繁殖技術(shù)的發(fā)展，提高馬鈴薯的經(jīng)濟(jì)效益。

脫毒馬鈴薯；試管微型薯繁殖技術(shù)；莖尖脫毒；病毒檢測(cè)

馬鈴薯是茄科茄屬的雙子葉種子植物，生產(chǎn)上絕大多數(shù)使用塊莖進(jìn)行無(wú)性繁殖。馬鈴薯受到病毒的侵染會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為花葉、卷葉、束頂?shù)劝Y狀。病毒會(huì)使植株生長(zhǎng)速度減緩，葉片卷曲壞死，塊莖變小、變尖、龜裂、內(nèi)部網(wǎng)狀壞死等，甚至?xí)グl(fā)芽能力，不能作為種子使用。病毒會(huì)逐年積累，病情會(huì)逐年加重，造成馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，侵染馬鈴薯的病毒有18種，其中9種是專門存在于馬鈴薯上的。

當(dāng)前解決因病毒引起的馬鈴薯退化問題，就培育無(wú)毒種薯，其中最行之有效的方法就是莖尖脫毒。馬鈴薯脫毒種薯是經(jīng)薯塊室內(nèi)催芽、切取莖尖分生組織、試管苗培養(yǎng)、切段快繁等一系列技術(shù)措施后獲得的，筆者結(jié)合多年研究、實(shí)踐操作經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出一套高效的脫毒馬鈴薯試管微型薯繁殖技術(shù)要點(diǎn)。

1 脫毒馬鈴薯試管微型薯繁殖技術(shù)要點(diǎn)

脫毒馬鈴薯試管微型薯繁殖技術(shù)要點(diǎn)：先將帶毒薯塊進(jìn)行催芽和消毒處理，然后在無(wú)菌條件下切取莖尖分生區(qū)組織，在試管中進(jìn)行培養(yǎng)，分生區(qū)組織生長(zhǎng)4個(gè)月，待莖尖分生區(qū)組織長(zhǎng)成植物苗后，對(duì)試管苗進(jìn)行病毒檢測(cè)，從中鑒定出不帶病毒的脫毒苗，再進(jìn)行切斷快繁，后進(jìn)行誘導(dǎo)、良種繁殖，最后選出具有原品種特性的脫毒馬鈴薯，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)壯的目的。

1.1 馬鈴薯莖尖分生組織誘導(dǎo)成脫毒苗

使用馬鈴薯莖尖分生區(qū)組織進(jìn)行體細(xì)胞培養(yǎng)。利用0.2mm左右、有2個(gè)葉原基的莖尖作為外植體，經(jīng)過分化發(fā)育成為植株。對(duì)馬鈴薯莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，通常有兩種方式。一種是對(duì)莖尖腋芽進(jìn)行誘導(dǎo)，成為植株；或者通過對(duì)不定芽進(jìn)行誘導(dǎo)，分化生成植株。對(duì)莖尖腋芽進(jìn)行誘導(dǎo)，可以直接生成植株。不定腋芽進(jìn)行誘導(dǎo)生成植物體需要經(jīng)歷對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化的程序，先分化成叢生芽，然后再對(duì)叢生芽進(jìn)行誘導(dǎo)獲得植株。對(duì)馬鈴薯莖尖脫毒一般使用第一種方法進(jìn)行誘導(dǎo)。在剝離莖尖和接種時(shí)，要對(duì)塊莖芽進(jìn)行嚴(yán)格消毒，接種馬鈴薯的培養(yǎng)基上不含任何激素，培養(yǎng)環(huán)境保持25℃，每天保持12h光照，經(jīng)過25d左右，小苗長(zhǎng)成4～5個(gè)小葉片，將其剪斷成單節(jié)段，并轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上。使用相同的方法擴(kuò)繁1～2個(gè)周期，等到小苗達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，再使用這些小苗剝離莖尖，這樣可以增加苗的成活率。

1.2 影響馬鈴薯莖尖脫毒成功率的因素

莖尖成苗率和小苗的脫毒率都對(duì)莖尖組織培養(yǎng)成功率產(chǎn)生影響，小苗的脫毒率是保障優(yōu)質(zhì)脫毒種薯成功率的關(guān)鍵。莖尖大小、溫度、培養(yǎng)基成分是影響馬鈴薯莖尖脫毒成功的主要因素。

1.2.1 莖尖大小

Mellor和StaceSmith研究了莖尖大小對(duì)X病毒去除的影響，研究顯示莖尖大小會(huì)對(duì)莖尖培養(yǎng)的脫毒率產(chǎn)生影響，莖尖越小，外植體所含的病毒量越少，脫毒成功率就越高，但不易成苗[3]。

1.2.2 溫度

Kassanis最早發(fā)現(xiàn)了高溫會(huì)造成病毒失活，他研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯莖在38℃下20d左右，其莖上的馬鈴薯卷葉病毒就消失了，可以獲得無(wú)卷葉病的植物。需要進(jìn)行莖尖培養(yǎng)時(shí)，可以通過高溫處理來除去一些病毒，可以提高馬鈴薯脫毒率[4]。

1.2.3 培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基的成分也會(huì)對(duì)馬鈴薯莖尖培養(yǎng)的成苗率產(chǎn)生影響，適當(dāng)含量的鉀離子和銨離子可以滿足莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的需要，提高脫毒成功率。通過加入病毒抑制劑能夠提高莖尖培養(yǎng)的脫毒效果，Lasky R.E在培養(yǎng)基中加入10mg/L病毒痤，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中馬鈴薯莖尖再生植株中80%已經(jīng)沒有PVX，說明培養(yǎng)基中加入病毒痤對(duì)PVX具有一定的破壞性[5]。

1.3 馬鈴薯脫毒苗的無(wú)土扦插快繁和脫毒試管微型薯的生產(chǎn)

1.3.1 馬鈴薯脫毒苗的無(wú)土扦插快繁技術(shù)

使用蛭石和爐渣作為基質(zhì)，施加適量氮磷鉀肥、生物有機(jī)肥和營(yíng)養(yǎng)液，一般配比70%的蛭石爐渣、30%的生物有機(jī)肥，每立方米添加100g磷酸二胺，并且需要定時(shí)添加營(yíng)養(yǎng)液，保證基質(zhì)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)充足，營(yíng)養(yǎng)液中氮、磷、鉀、鈣、鎂等元素要搭配適當(dāng)。

扦插的時(shí)間會(huì)對(duì)脫毒苗生根產(chǎn)生影響，這主要是受到溫度的影響，溫度越高生根天數(shù)越少，溫度越低，生根天數(shù)越多，但是溫度過高會(huì)造成扦插苗成活率降低。研究表明，最佳的扦插苗溫度為（20±7）℃。在扦插苗實(shí)驗(yàn)中，遮蔭會(huì)降低生根率，但是可以提高成活率，因此，溫度和光照都對(duì)生根和成活有著重要影響。

1.3.2 馬鈴薯脫毒微型薯的生產(chǎn)

脫毒微型薯是指使用組織培養(yǎng)方法獲得的脫毒試管苗。激素和病蟲害都會(huì)影響微型薯成活率，在進(jìn)行微型薯生產(chǎn)時(shí)，要對(duì)密度、光照、水肥、病蟲害、激素等進(jìn)行分析，從而獲得健壯的馬鈴薯脫毒苗。可以采用4次剪尖和4次培土的方法，在80d單株結(jié)薯10.6個(gè)，110d單株商品粒數(shù)大于1g的達(dá)到8.7個(gè)，通過剪尖培土，可以增加結(jié)薯數(shù)量。

利用無(wú)土栽培技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)以及快速繁殖技術(shù)相結(jié)合，可以快速生產(chǎn)出無(wú)病毒種薯。使用比重輕的固體材料作為基質(zhì)，多種營(yíng)養(yǎng)液可以保證脫毒苗所需的充足的水分和養(yǎng)分，利用人工控制可以在較短時(shí)間內(nèi)結(jié)薯。馬鈴薯脫毒微型薯生產(chǎn)技術(shù)使用設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、可以工廠化生產(chǎn)，在近年來發(fā)展比較快。通過無(wú)土栽培可以在植物生長(zhǎng)到合適程度，對(duì)植物體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行調(diào)整，可以促進(jìn)匍匐莖發(fā)育膨脹，外界環(huán)境可以對(duì)植物體內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響。

馬鈴薯生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)具有較大影響，環(huán)境溫度、濕度、溫差、光照、營(yíng)養(yǎng)成分、N、P、K營(yíng)養(yǎng)元素的比例都會(huì)對(duì)匍匐莖的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。謝慶華[7]通過4次剪尖和4次培土，研究發(fā)現(xiàn)，通過增加剪尖和培土次數(shù)能夠提高馬鈴薯的產(chǎn)量。梁東超對(duì)扦插時(shí)期的環(huán)境因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明扦插時(shí)期、光照和馬鈴薯密度都會(huì)對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)造成影響。不同的扦插時(shí)期，會(huì)對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量產(chǎn)生影響。光照對(duì)溫度產(chǎn)生影響，進(jìn)而對(duì)試管苗生根產(chǎn)生影響[8]。

1980年前后，我國(guó)使用日本通用配方和K5營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行馬鈴薯培養(yǎng)，在1990年之后對(duì)配方進(jìn)行了改進(jìn)。李文剛[6]發(fā)現(xiàn)B9會(huì)對(duì)莖膨大結(jié)薯產(chǎn)生直接影響，能夠促進(jìn)結(jié)薯。

2 脫毒馬鈴薯的病毒檢測(cè)

馬鈴薯病毒對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量具有重要影響。20世紀(jì)80年代馬鈴薯病毒檢測(cè)有了新的進(jìn)步，馬鈴薯病毒的分離和鑒定技術(shù)得到發(fā)展。馬鈴薯病毒鑒定技術(shù)經(jīng)過生物學(xué)鑒定法、化學(xué)鑒定法發(fā)展到血清鑒定法、ELISA、PCR檢測(cè)等，普遍使用的鑒定方法有ELISA檢測(cè)方法和PCR檢測(cè)方法。

ELISA檢測(cè)方法：ELISA檢測(cè)過程中參照試劑使用說明，樣品研磨后，加入1mL緩沖液，4000rp離心3min，在所設(shè)置的陰陽(yáng)兩個(gè)對(duì)照孔中分別加入100μL陰性和陽(yáng)性對(duì)照液，37℃孵育3h，洗板后加入100μL IgG-AP，37℃孵育2h，洗板后加入100μL底物溶液，37℃孵育20min。在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定待檢樣品和對(duì)照樣品的OD值進(jìn)行檢測(cè)。利用病毒顆粒可以同抗體在離體的情況下發(fā)生反應(yīng)，通過酶能夠?qū)@個(gè)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，從而可以判斷是否含有病毒。值得注意的是ELISA技術(shù)檢測(cè)的目標(biāo)是PVS的CP蛋白，但PVS經(jīng)常變異，一旦變異，檢測(cè)中如試劑盒抗體為單克隆抗體，多會(huì)出現(xiàn)漏診，因此ELISA試劑盒抗體中，單克隆抗體需涵蓋所有基因類型，多克隆抗體應(yīng)擁有更寬檢測(cè)范圍，這樣才能避免檢測(cè)中出現(xiàn)漏診。

PCR檢測(cè)技術(shù)：PCR檢測(cè)技術(shù)是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而發(fā)展起來的技術(shù)，檢測(cè)過程中需按照總RNA提取→cDNA合成→PCR擴(kuò)增→擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)→限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析這樣的檢測(cè)流程進(jìn)行，這種檢測(cè)方法可以在體外迅速將目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增。PCR檢測(cè)技術(shù)不用制作抗血清，并且檢測(cè)準(zhǔn)確度高，能夠有效地對(duì)植物病毒進(jìn)行檢測(cè)，是一種新型的分子檢測(cè)方法。但是RT-PCR檢測(cè)過程中，檢測(cè)人員需經(jīng)常性對(duì)檢測(cè)引物進(jìn)行改進(jìn)，這樣才能確保RT-PCR檢測(cè)的廣譜適應(yīng)性，確保RT-PCR可對(duì)病毒所有株系進(jìn)行有效檢測(cè)。PCR技術(shù)憑借獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在植物病毒檢測(cè)方面發(fā)展迅速，該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于梨果病毒檢測(cè)、小麥花葉病毒檢測(cè)、馬鈴薯病毒檢測(cè)等。

總而言之，使用脫毒技術(shù)進(jìn)行馬鈴薯試管微型薯繁殖，對(duì)繁殖周期和植物生長(zhǎng)環(huán)境的要求比較低，同時(shí)能夠有效保障和提高馬鈴薯種薯的質(zhì)量，有利于培養(yǎng)和快速推廣馬鈴薯新品種。同時(shí)也減少了馬鈴薯的使用量，能夠很大程度上降低馬鈴薯的生產(chǎn)成本，改變了傳統(tǒng)的馬鈴薯生產(chǎn)體系，對(duì)全球馬鈴薯生產(chǎn)具有重要影響。

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[5]Lasky R E,Lechtig A,Delgado H,et al.Birth weight and psychomotor performance in rural Guatemala[J].American Journal of Diseases ofChildren,1975,129(5):566.

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The Test Tube Micro Potato Propagation Technology of Virus-free Potato

MA Ji
(Academy of Agricultural Sciences Plant Virus-free Seedling Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150086,China)

The potato will be degraded by the invasion of the virus,which will affect the yield of potato.The test tube micro potato propagation technology,with breeding technology,and the cultivation of potato varieties,can accelerate the promotion of new varieties of potato,potato to reduce production costs,and improve the quality of potato.Based on virusfree technology analyzed,the author researched the test tube micro potato propagation technology,and analyzed breeding technology of virus detection methods,in order to promote the development of reproduction technology of virus-free potato microtuber,promote potato production efficiency.

Virus-free potato;test tube micro potato propagation technology;Shoot tip detoxification;virus detection

S532

A

1008-1038(2017)05-0073-03

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.05.022

2016-12-26

馬紀(jì)（1967—）女，副研究員，研究方向?yàn)槊摱抉R鈴薯試管苗及微型薯栽培